تأثیر صدا و تراکم نگهداری بر استرس، رفتار و میکروبیوم سکوم مرغ‌های تخمگذار

فایل PDF مقاله را اینجا دانلود کنید :

در چین، پرورش قفسی فشرده در حال حاضر شیوه اصلی پرورشی است که مزارع متعارف مرغ به دلیل هزینه پایین، مدیریت آسان و سودآوری بالای آن اتخاذ کرده‌اند. طبق مقررات اتحادیه اروپا، تراکم نگهداری مرغان تخم‌گذار نباید کمتر از 750 سانتی‌متر مربع برای هر پرنده باشد (Kang و همکاران، 2016)، در حالی که تراکم نگهداری رایج مرغان تخم‌گذار در چین حدود 450 تا 500 سانتی‌متر مربع برای هر پرنده است. علاوه بر این، با ارتقا و بهینه‌سازی مزارع، تراکم نگهداری برخی مرغان تخم‌گذار به دلیل کمبود فضا می‌تواند تا درجه بیشتری کاهش یابد. فضای محدود در دسترس مرغان تخم‌گذار پرورش‌یافته به‌صورت فشرده، مجموعه‌ای از نگرانی‌ها را پدید آورده است، از جمله افزایش بروز بیماری‌ها (Fang و همکاران، 2021)، بالا رفتن سطح استرس و کاهش رفاه حیوانی (Kaya و همکاران، 2021).

در همین حال، مزارع مرغ معمولاً برای تسهیل حمل‌ونقل مرغ‌ها و محصولات آن‌ها در فاصله‌ای نه چندان دور از بزرگراه‌ها قرار دارند. بنابراین مرغ‌ها ناگزیر در معرض دو عامل محیطی منفی، یعنی تراکم بالای نگهداری و نویز ترکیبی جاده، قرار دارند که ارتباط نزدیکی دارند با افزایش استرس (Campo, Gil & Da, 2005؛ Houshmand و همکاران، 2012؛ Sugiharto, 2022)، کاهش رشد (von Eugen و همکاران، 2019؛ Goo و همکاران، 2019؛ Hanafi و همکاران، 2023)، آسیب به سلامت (Flores و همکاران، 2019؛ Shehata و همکاران، 2022) و به خطر افتادن عملکرد تولیدی (Brouček, 2014؛ Ciborowska, Michalczuk & Bien, 2021). طراحی راهبردهای جایگزین برای بهینه‌سازی نظام نگهداری قفسی می‌تواند راه‌حلی عملی برای کاهش این اثرات نامطلوب فراهم کند، الزامات تخفیف رفاه حیوانی مرتبط با تراکم بالا و نویز را برآورده سازد و تقاضای روزافزون مصرف‌کنندگان برای محصولات حاصل از حیوانات کم‌استرس‌تر را تأمین کند.

در مرغ، هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) و کورتیکوسترون (CORT) دو هورمون محور هیپوتالاموس–هیپوفیز–آدرنال (HPA) هستند که نقش‌های حیاتی در پاسخ‌های استرسی دارند (Cheng & Muir, 2004). افزایش سطوح گردش خونی ACTH و CORT معمولاً به‌عنوان شاخص‌های استرس اندازه‌گیری می‌شود (Ralph و همکاران، 2015؛ Weimer و همکاران، 2018؛ Bi و همکاران، 2022؛ Wang و همکاران، 2023). گزارش‌های انباشته نشان داد که تراکم بالای نگهداری (Onbaşılar & Aksoy, 2005؛ Kang و همکاران، 2016؛ Yu و همکاران، 2021) و مواجهه با نویز (Chloupek و همکاران، 2009) دو عامل محیطی هستند که می‌توانند سطح CORT گردش خون را افزایش دهند، در حالی که تراکم پایین نگهداری (Shehata و همکاران، 2022) و تقویت شنیداری با موسیقی (Dávila و همکاران، 2011) با شرایط کم‌استرس‌تر همراه بوده‌اند. از آنجا که تراکم بالای نگهداری و نویز چالش‌هایی هستند و حیوانات را وادار می‌کنند برای منابع محدود غذا و فضا رقابت کنند، قابل پیش‌بینی است که رفتارهای غیرطبیعی ناشی از استرس در نتیجه تراکم ازدحام و نویز محیطی افزایش یابد.

برخلاف نویز، ثابت شده است که موسیقی به‌طور مؤثری محیط دام و طیور را غنی می‌کند (Alworth & Buerkle, 2013) و رفاه حیوان را با پوشاندن نویزهای زمینه بالقوه مزاحم، کاهش اضطراب، استرس و رفتارهای غیرطبیعی و فراهم‌کردن غنی‌سازی شنیداری بهبود می‌بخشد (Patterson-kane & Farnworth, 2006؛ Papoutsoglou و همکاران، 2007؛ Rickard, 2009).

از سوی دیگر، میکروب‌های موجود در دستگاه گوارش (GIT) مرغ در هضم و جذب مواد مغذی، کنترل عوامل بیماری‌زا و تنظیم ایمنی نقش‌های مهمی دارند (Oakley و همکاران، 2014). سکوم مرغ که بیشترین غلظت میکروبی و طولانی‌ترین زمان ماندگاری محتویات گوارشی را در دستگاه گوارش دارد، محل اصلی تخمیر باکتریایی گسترده پلی‌ساکاریدهای غیرنشاسته‌ای (NSPs) و محفظه اصلی تولید اسیدهای چرب کوتاه‌زنجیر (SCFAs) است (Józefiak, Rutkowski & Martin, 2004). SCFAها (به‌ویژه اسیدهای بوتیریک و پروپیونیک) در حفظ فیزیولوژی سالم روده و بهبود عملکرد تولیدی در مرغ، از نظر وزن بدن، ضریب تبدیل خوراک و کیفیت گوشت، نقش مهمی ایفا می‌کنند (Scicutella و همکاران، 2021). بنابراین، غنی‌شدن جوامع باکتریایی تولیدکننده SCFA در سکوم ممکن است زیست‌نشانگرهای بالقوه‌ای باشند که وضعیت سلامت روده مرغ را بازتاب می‌دهند. گزارش شده است که استرس با تغییر میکروبیوتای روده ارتباط داشت و میکروبیوتای روده از طریق محور میکروبیوتا–روده–مغز در اثرات هورمون‌های محور HPA و رفتارها نقش مهمی ایفا می‌کرد (Bienenstock, Kunze & Forsythe, 2015؛ Kraimi و همکاران، 2019).

تراکم بالای نگهداری و نویز محیطی عوامل استرس‌زای رایجی هستند که بر سلامت و عملکرد طیور اثر نامطلوب می‌گذارند، در حالی که تراکم پایین و موسیقی ممکن است نقش‌های معکوس داشته باشند. سطح هورمون‌های استرس و رفتارها معمولاً برای برآورد رفاه حیوان به کار می‌روند (Costa و همکاران، 2012؛ Johnson و همکاران، 2019). تغییرات میکروبیوتای روده در حیوانات، به‌ویژه تغییرات در نسبت فلور مفید، بازتاب‌دهنده سلامت روده آن‌هاست. حیواناتی که وضعیت سلامت و رفاه بهتری دارند ممکن است کیفیت محصول بهتری داشته باشند که برای مصرف‌کنندگان نیز سودمند است. با این حال، در حال حاضر نسبتاً اندک دانسته می‌شود که آیا منابع صدا و تراکم‌های نگهداری، به‌ویژه در ترکیب با هم، تأثیری بر ترکیب و عملکرد جوامع باکتریایی روده در مرغان تخم‌گذار دارند یا نه.

در اینجا، این مطالعه برای بررسی اینکه تراکم‌های مختلف نگهداری (پایین، متوسط و بالا) و مواجهه با صداهای مختلف (صدای طبیعی، موسیقی بی‌کلام و نویز ترافیک) چگونه می‌توانند بالقوه بر استرس فیزیولوژیک (سطوح ACTH و CORT سرم)، رفتارها (پرآرایی و نوک‌زدن پر) و جوامع باکتریایی سکوم در مرغان تخم‌گذار سبزپوسته شیان‌دائو (Xiandao) اثر بگذارند انجام شد؛ نژادی بومی چین با عملکرد تخم‌گذاری عالی و اهمیت روزافزون در چین. مرغان تخم‌گذار سبزپوسته شیان‌دائو سازگاری خوبی دارند و می‌توانند هم در شمال و هم در جنوب چین پرورش یابند (Zhou و همکاران، 2021). با توجه به عادات مصرفی چینی‌ها، تخم‌مرغ‌های سبزپوسته از تخم‌مرغ‌های سفیدپوسته محبوب‌ترند (Xu و همکاران، 2024). علاوه بر این، به دلیل ویتامین‌ها، عناصر کمیاب و اسیدهای آمینه بیشتر و کلسترول و چربی کمتر، تخم‌مرغ‌های سبزپوسته غذای سلامت طبیعی ایده‌آلی به شمار می‌روند (Li و همکاران، 2016). فرضیه ما این بود که تراکم پایین نگهداری و مواجهه با موسیقی ممکن است به کاهش نشانگرهای سرمی استرس، کاهش رفتارهای مرتبط با استرس و احتمالاً سود رساندن به میکروبیوتای روده در مرغان تخم‌گذار کمک کند. علاوه بر این، امیدواریم شواهدی ارائه کنیم که آیا کاهش کیفیت محصول ناشی از تراکم‌های بالای نگهداری را می‌توان با پخش موسیقی و بدون به خطر انداختن وضعیت سلامت و رفاه مرغان تخم‌گذار بهبود بخشید.

مواد و روش‌ها

ملاحظات اخلاقی

کار با حیوانات در این آزمایش مطابق با دستورالعمل‌های چین برای رفاه حیوانات انجام شد و کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه یانگ‌جو (شماره 202104501)، استان جیانگ‌سو، جمهوری خلق چین، آن را تأیید کرد.

حیوانات و شرایط نگهداری

این مطالعه در یک مزرعه تجاری، شرکت طیور هه‌هنگ شیان‌دائو (ناحیه جیانگ‌یان، شهر تای‌جو، استان جیانگ‌سو، چین) (شماره مجوز: GB14925-2010) انجام شد. مزرعه از اصل «همه‌داخل، همه‌خارج» پیروی می‌کرد. آزمایش‌های میدانی را کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه یانگ‌جو (شماره تأییدیه: 202104501) تأیید کرد. در مجموع 378 قطعه مرغ تخم‌گذار سالم 30 هفته‌ای سبزپوسته شیان‌دائو (Gallus gallus domesticus) برای این آزمایش به کار رفت. این مرغان تخم‌گذار تحت شرایط یکسان تغذیه و مدیریت پرورش یافتند. پیش از آغاز آزمایش، آن‌ها در قفس‌های تجاری استاندارد (به ابعاد 38.5 سانتی‌متر طول × 36.5 سانتی‌متر عرض × 36 سانتی‌متر ارتفاع) با سه پرنده در هر قفس نگهداری می‌شدند که تراکم نگهداری تقریباً 468 سانتی‌متر مربع برای هر پرنده ایجاد می‌کرد. برای هدف آزمایش حاضر، از هر قفس یک مرغ بر اساس وزن بدن قابل‌مقایسه که در محدوده تقریباً 1.4 تا 1.6 کیلوگرم بود انتخاب شد.

مرغان تخم‌گذار در سه سالن مرغداری جداگانه (7.1 × 2.7 × 4 متر، طول × عرض × ارتفاع) تحت شرایط محیطی نیمه‌کنترل‌شده نگهداری شدند. این‌ها سه سالن مرغداری مستقل هستند که یک فضای سبز به عرض 19 متر آن‌ها را از هم جدا می‌کند تا تداخل صوتی بالقوه میان آن‌ها به حداقل برسد. همه امکانات و شرایط دیگر در این سه سالن یکسان بود. جیره فرمولی تجاری مورد استفاده در این مطالعه، یک خوراک پایه ذرت و سویا به‌صورت پلت و بدون مکمل آنتی‌بیوتیکی بود که شرکت طیور هه‌هنگ شیان‌دائو آن را برای تأمین توصیه‌های مواد مغذی مرغان تخم‌گذار طبق «نیازهای تغذیه‌ای مرغ در چین» (NY/T 33-2004) تولید کرده بود. ترکیب و سطوح مواد مغذی جیره پایه در جدول S1 ارائه شده است.

در طول دوره آزمایش، مرغان تخم‌گذار دسترسی آزاد به خوراک و آب داشتند. برنامه نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در روز بود. خوراک‌دهی دو بار در روز (ساعت 7:00 صبح و 15:00 بعدازظهر) انجام می‌شد. میانگین دما و رطوبت نسبی اتاق به‌ترتیب 20 ± 3 درجه سانتی‌گراد و 65 تا 70 درصد بود. آزمایش پس از یک هفته دوره سازگاری، 24 روز طول کشید.

طرح آزمایشی

بر پایه یک آرایش فاکتوریل 3 × 3 با سه سطح منبع صدا و سه سطح تراکم نگهداری، مرغان تخم‌گذار به‌طور تصادفی در نه گروه قرار گرفتند. مرغان تخم‌گذار در سه سالن مرغداری به‌ترتیب در معرض صدای طبیعی (NS)، صدای موسیقی بی‌کلام (IMS) و صدای ترکیبی جاده (MRS) قرار گرفتند. NS صدای محیطی سالن مرغداری بود. IMS کوارتت‌های زهی موتسارت بود (Dávila و همکاران، 2011). MRS ضبطی از نویز ترافیک اطراف شرکت طیور هه‌هنگ شیان‌دائو بود. موسیقی و صدای ترکیبی جاده با شدت 65 تا 75 دسی‌بل با رادیوی SAST T-50 دو بار در روز، از 8:00 تا 11:00 صبح و از 13:00 تا 16:00 بعدازظهر، پخش شد.

مرغان تخم‌گذار در قفس‌های سیمی گالوانیزه (70 سانتی‌متر طول × 51 سانتی‌متر عرض × 61 سانتی‌متر ارتفاع، که مساحت کف 3,570 سانتی‌متر مربع را به دست می‌داد) نگهداری شدند. تنظیم تراکم‌های مختلف نگهداری در این آزمایش بر پایه رویه صنعت بود. در حال حاضر، تراکم نگهداری متعارف به‌کاررفته در مزارع فشرده مرغ در چین 450 تا 500 سانتی‌متر مربع برای هر پرنده است. بر این اساس، تراکم‌های نگهداری به‌کاررفته در این مطالعه به‌صورت تراکم پایین (LD)، متوسط (MD) و بالا (HD) تعیین شد که به‌ترتیب متناظر با چهار پرنده در هر قفس (892 سانتی‌متر مربع برای هر پرنده)، هفت پرنده در هر قفس (510 سانتی‌متر مربع برای هر پرنده) و 10 پرنده در هر قفس (357 سانتی‌متر مربع برای هر پرنده) بود.

بر اساس ترکیب منابع مختلف صدا و تراکم‌های مختلف نگهداری، نه گروه تیماری وجود داشت که با نام‌های NL (NS + LD)، NM (NS + MD)، NH (NS + HD)، IML (IMS + LD)، IMM (IMS + MD)، IMH (IMS + HD)، MRL (MRS + LD)، MRM (MRS + MD) و MRH (MRS + HD) مشخص شدند. هر گروه شامل شش تکرار بود. در هر سالن مرغداری 18 قفس، و در مجموع 126 مرغ تخم‌گذار در هر اتاق، وجود داشت و 18 قفس در هر سالن به‌طور تصادفی در شش ردیف چیده شد (شکل S1). رادیوها در مرکز سالن‌ها قرار گرفتند و روی پایه‌ها بالا برده شدند تا اطمینان حاصل شود که اختلاف دسی‌بل اتاق‌های داخلی از 10 دسی‌بل بیشتر نشود.

جمع‌آوری نمونه و تجزیه

در روزهای سوم، دوازدهم و بیست‌وچهارم آزمایش (به‌ترتیب D3، D12 و D24)، از شش پرنده انتخاب‌شده تصادفی (یک مرغ تخم‌گذار از هر تکرار) (n = 6) نمونه خون گرفته شد. به‌طور خلاصه، خون ورید زیر بال (حدود 5 میلی‌لیتر برای هر مرغ) از طریق سوراخ‌کردن ورید با لوله‌های وکیوتینر فاقد EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) گرفته شد. نمونه خون به مدت نیم ساعت در دمای اتاق ماند تا لخته شود، سپس سرم با یک مرحله سانتریفیوژ (3,000 × g به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد) جمع‌آوری شد. غلظت ACTH و CORT در سرم با کیت‌های تجاری آزمون ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) (AMOKE, Lianshuo Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) مطابق دستورالعمل سازنده اندازه‌گیری شد. منحنی‌های استاندارد ساخته‌شده برای هر یک از هورمون‌های سنجش‌شده مقدار رگرسیون بالاتر از 0.99 داشتند. ضرایب تغییرات درون‌سنجشی و بین‌سنجشی برای ACTH و CORT کمتر از 9 و 11 درصد بود.

مشاهده رفتارها، شامل پرآرایی و نوک‌زدن پر، با روش نمونه‌برداری کانونی از حیوان انجام شد. پرآرایی زمانی ثبت می‌شد که مرغ تخم‌گذار از منقار خود برای نوک‌زدن، نوازش یا شانه‌زدن پرها استفاده کند (Ventura, Siewerdt & Estevez, 2012). نوک‌زدن پر یعنی مرغ تخم‌گذار به سمت پرهای دیگران در قفس نوک بزند (Li و همکاران، 2019). تصاویر نمایانگر که این دو رفتار خاص را توضیح می‌دهند در شکل S2 و ویدیوهای S1 و S2 نشان داده شده است.

به‌طور خلاصه، یک سامانه دوربین بالاسری برای ثبت رفتار مرغان تخم‌گذار در D3، D12 و D24 به مدت 15 دقیقه (از 9:00 تا 9:15) به کار رفت. پانزده پرنده در هر گروه (دو یا سه مرغ تخم‌گذار از هر تکرار) به‌طور تصادفی برای ارزیابی رفتار انتخاب شدند (n = 15). این پرندگان انتخاب‌شده با علامت‌های پا (یک حلقه پا از جنس پلاستیک که به ساق بسته شده بود) از هم متمایز می‌شدند. رفتار ثبت‌شده این پرندگان انتخاب‌شده و علامت‌دار با Noldus Observer XT (نسخه 7.0، Noldus Information Technology BV, Wageningen, Netherland) و توسط یک ناظر واحد که از تیمارها بی‌اطلاع بود تحلیل شد. وقتی ناظر رفتار هدف را مشاهده می‌کرد، از نرم‌افزار (Noldus Observer XT) برای ثبت آن استفاده می‌کرد. پایان یک رفتار هدف با مشاهده فاصله 4 ثانیه پس از توقف رفتار یا هنگام انجام رفتار دیگر تعیین می‌شد. فراوانی رفتار (تعداد، n) و مدت رفتار (ثانیه، s) به‌ترتیب به‌صورت تعداد دفعات و کل مدت وقوع رفتار مشاهده‌شده برای هر پرنده در دوره مشاهده تعریف شد.

در پایان آزمایش، همه مرغان تخم‌گذار یک شب ناشتا ماندند و شش پرنده انتخاب‌شده تصادفی (یک مرغ تخم‌گذار از هر تکرار) با جابه‌جایی مهره‌های گردن معدوم شدند (n = 6). سکوم‌ها با قیچی استریل از دستگاه گوارش جدا شدند. محتویات هر دو سکوم با دقت و با دست درون لوله‌های پلاستیکی آسپتیک تخلیه شد، بی‌درنگ در نیتروژن مایع فرو برده شد و برای تحلیل بعدی توالی‌یابی آمپلیکون 16S rRNA در دمای 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. پس از آزمون، سایر مرغان تخم‌گذار برای مقاصد پرورش و تولید در شرکت طیور هه‌هنگ شیان‌دائو (ناحیه جیانگ‌یان، شهر تای‌جو، استان جیانگ‌سو، چین) ماندند.

برای ارزیابی ترکیب میکروبیوتای سکوم در گروه‌های تیماری مختلف، محتویات سکوم (حدود 0.5 گرم در هر نمونه) برای تکثیر و توالی‌یابی ناحیه بسیار متغیر V4–V5 ژن 16S rRNA به کار رفت که کارکنان شرکت Genepioneer Biotechnologies Co. Ltd. (نانجینگ، چین) آن را انجام دادند. به‌طور خلاصه، DNA کل جامعه میکروبی در محتویات سکوم با کیت QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen, Hilden, Germany) مطابق دستورالعمل تولیدکننده استخراج شد. کمیت و کیفیت DNA ژنومی میکروبی با اسپکتروفتومتر NanoDrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) و الکتروفورز ژل آگارز 1.5 درصد به‌صورت اسپکتروفتومتری بررسی شد. ناحیه V4–V5 ژن 16S rRNA با مجموعه پرایمر 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′) و 907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′) تکثیر شد. جزئیات مربوط به ترکیب سامانه PCR، شرایط چرخه‌های حرارتی و اتصال محصولات PCR با شاخص یکتا مطابق توصیف‌های پیشین (Fadrosh و همکاران، 2014) انجام شد. محصولات PCR به‌دست‌آمده با کیت AxyPrep DNA Gel Extraction (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) خالص‌سازی و با فلوریمتر Qubit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) کمّی شدند. مقادیر هم‌مولار آمپلیکون‌های ژن 16S rRNA با بارکدهای متفاوت از هر نمونه ادغام و روی بستر Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA) توالی‌یابی شدند.

خوانش‌های به‌دست‌آمده بر اساس بارکدها به نمونه‌های مختلف اختصاص داده شدند. خوانش‌های توالی کم‌کیفیت در صورتی حذف شدند که طولشان کمتر از 200 جفت‌باز بود، میانگین امتیاز phred آن‌ها کمتر از 20 بود، شامل بازهای مبهم بودند یا شامل هوموپلیمرهای بزرگ‌تر از 9 جفت‌باز بودند. توالی‌هایی که از فیلتر کیفیت عبور کردند با FLASH v1.2.7 ادغام شدند. توالی‌های کایمریک با مقایسه با پایگاه داده مرجع (Gold Database) با الگوریتم UCHIME شناسایی و با پایگاه داده USEARCH 6.1 حذف شدند (Edgar, 2013). توالی‌های مؤثر حاصل با فراخوانی uclust از Qiime در آستانه یکسانی 97 درصد شباهت در واحدهای آرایه‌شناختی عملیاتی (OTU) خوشه‌بندی شدند (Caporaso و همکاران، 2010). تابع rarefy در خط لوله QIIME برای اجتناب از اثرات تفاوت عمق توالی‌یابی بر اندازه‌گیری ترکیب‌های باکتریایی به کار رفت. برای هر OTU، بلندترین توالی در هر خوشه به‌عنوان نماینده انتخاب شد و برای حاشیه‌نویسی اطلاعات آرایه‌شناختی با RDP Classifier و پایگاه داده توالی Silva 16S به کار رفت.

هر دو شاخص تنوع آلفا و بتا با نرم‌افزار QIIME (نسخه 1.9.1) محاسبه شدند و برای برآورد تنوع میکروبیوم درون و میان جوامع باکتریایی به کار رفتند. نمودارهای مقیاس‌بندی چندبعدی غیرمتریک (NMDS) با استفاده از مقادیر ناهمانندی Bray-Curtis ساخته شدند. تحلیل واریانس جایگشتی (PERMANOVA) از بسته Vegan نرم‌افزار R برای مقایسه اثرات صدا و تراکم بر ساختار جوامع به کار رفت. الگوریتم LEfSe برای انجام تحلیل تشخیصی خطی (LDA) روی نمونه‌ها بر اساس ترکیب‌های آرایه‌شناختی به کار رفت (Segata و همکاران، 2011). تفاوت‌های دارای امتیاز LDA > 4.0 و مقدار P < 0.05 از نظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شدند.

توانمندی‌های عملکردی جوامع باکتریایی سکوم با PICRUSt بر اساس فراوانی در سطح OTU پیش‌بینی شد (Langille و همکاران، 2013). ژن‌های پیش‌بینی‌شده و عملکرد آن‌ها با مسیرهای دایره‌المعارف ژن‌ها و ژنوم‌های کیوتو (KEGG) تطبیق داده شد و تفاوت‌های میان گروه‌ها با STAMP مقایسه شد. آزمون t دوطرفه Welch و تصحیح FDR بنجامینی–هوخبرگ به کار رفت.

تحلیل آماری

آزمایش به‌صورت طرح کاملاً تصادفی اجرا شد. داده‌های به‌دست‌آمده از این مطالعه با SPSS 22.0 برای ویندوز (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) تحلیل آماری شدند. پیش از تحلیل، توزیع نرمال داده‌ها و همچنین استقلال و همگنی واریانس‌ها بین گروه‌های تیماری بررسی شد. برای اندازه‌گیری‌های سرمی، داده‌های روزهای مختلف با تحلیل واریانس دوطرفه در آرایش فاکتوریل 3 × 3 با سه سطح تراکم نگهداری (LD، MD و HD) و سه منبع مختلف صدا (NS، IMS و MRS) تحلیل شدند تا اثرات اصلی صدا و تراکم نگهداری به‌تنهایی و نیز اثرات متقابل آن‌ها بررسی شود. هنگامی که اثرات متقابل وجود داشت، تحلیل اثر ساده انجام شد. آزمون دانکن برای مقایسه‌های چندگانه پس‌ازآزمون به کار رفت. داده‌های رفتاری روزهای مختلف با مدل‌های خطی تعمیم‌یافته آمیخته (GLMM) با منبع صدا و تراکم نگهداری به‌عنوان عوامل ثابت و افراد به‌عنوان عامل تصادفی تحلیل شدند. مدل‌ها شامل رفتارهای فراوانی و مدت پرآرایی و نوک‌زدن پر (به‌ترتیب Freqpreen، Freqpeck، Durapreen و Durapeck) به‌عنوان متغیرهای هدف، و منبع صدا، تراکم نگهداری و اثر متقابل آن‌ها به‌عنوان اثرات ثابت بودند. ما خطای توزیع پواسون با تابع پیوند لگاریتمی را برای Freqpreen و Freqpeck، و خطای توزیع نرمال با تابع پیوند همانی را برای Durapreen و Durapeck برقرار کردیم. مقایسه‌های زوجی پس‌ازآزمون با تصحیح بونفرونی تعدیل شد. برای تحلیل بیوانفورماتیک، شاخص‌های تنوع آلفا (گونه‌های مشاهده‌شده، Chao 1، پوشش Good، PD whole tree، شاخص‌های Shannon و Simpson)، تحلیل تنوع بتای فاصله Bray-Curtis و فراوانی نسبی باکتری‌ها با نرم‌افزار QIIME محاسبه شدند. NMDS برای تصویرسازی ماتریس ناهمانندی بین نمونه‌ها انتخاب شد که از طریق فاصله Bray-Curtis برای تنوع بتا محاسبه شده بود. آرایه‌های دارای فراوانی تفاضلی با تحلیل اندازه اثر تحلیل تشخیصی خطی (LDA) یعنی LEfSe شناسایی شدند. پیش‌بینی و حاشیه‌نویسی عملکردهای زیستی باکتری‌های سکوم با مسیر KEGG و PICRUSt انجام شد. علاوه بر این، تفاوت‌های بین دو گروه در داده‌های آرایه‌شناختی و تنوع با آزمون t دوطرفه Welch مقایسه شد. برای مقایسه چندگروهی، تحلیل‌های واریانس دوطرفه (ANOVA) همراه با آزمون کروسکال–والیس به کار رفت. تحلیل آماری با داده‌های تبدیل‌شده انجام شد، در حالی که میانگین‌های داده‌های خام برای ارائه استفاده شدند. داده‌ها به‌صورت میانگین ± SEM ارائه شده‌اند. مقدار P کمتر از 0.05 معنی‌دار در نظر گرفته شد.

نتایج

سطوح ACTH و CORT سرم

در سه نقطه نمونه‌برداری، هیچ اثر متقابل معنی‌داری بین منبع صدا و تراکم نگهداری بر سطوح ACTH و CORT سرم مشاهده نشد. اثرات اصلی معنی‌دار منبع صدا بر غلظت‌های ACTH (P(sound) < 0.001) و CORT (P(sound) = 0.029) سرم فقط در مرحله اولیه این آزمایش (D3) مشاهده شد و مرغان تخم‌گذار گروه MRS بالاترین سطوح را داشتند. اثرات اصلی معنی‌دار تراکم نگهداری بر سطوح ACTH و CORT سرم در D12 و D24 مشاهده شد (P(density) ≤ 0.002). مرغان تخم‌گذار نگهداری‌شده در HD با سطوح ACTH و CORT به‌طور معنی‌داری بالاتر از مرغان تخم‌گذار نگهداری‌شده در LD مشخص می‌شدند (جدول 1).

نتایج ما نشان داد IMS و LD با کاهش سطوح دو هورمون مرتبط با استرس همراه بودند، در حالی که MRS و HD می‌توانستند سطوح ACTH و CORT را افزایش دهند.

جدول 1. سطوح سرمی هورمون‌های مرتبط با استرس در نقاط نمونه‌برداری مختلف (n = 6)

یادداشت‌ها: ACTH، هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک؛ CORT، کورتیکوسترون؛ NS، صدای طبیعی؛ IMS، موسیقی بی‌کلام؛ MRS، صدای ترکیبی جاده؛ LD، تراکم پایین؛ MD، تراکم متوسط؛ HD، تراکم بالا؛ NL، NS + LD؛ NM، NS + MD؛ NH، NS + HD؛ IML، IMS + LD؛ IMM، IMS + MD؛ IMH، IMS + HD؛ MRL، MRS + LD؛ MRM، MRS + MD؛ MRH، MRS + HD. داده‌ها به‌صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین (SEM) ارائه شده‌اند. a,b: میانگین‌هایی با حروف کوچک متفاوت در یک ستون نشان‌دهنده تفاوت‌های معنی‌دار (P ≤ 0.05) هستند. A,B,C: میانگین‌هایی با حروف بزرگ متفاوت در یک ستون نشان‌دهنده تفاوت‌های بسیار معنی‌دار (P ≤ 0.01) هستند.

مشاهده رفتار

فراوانی و مدت رفتارهای پرآرایی

در D3، اثرات متقابل معنی‌دار S × D (صدا و تراکم) بر رفتارهای پرآرایی مشاهده شد. تحت LD و HD، مرغان تخم‌گذار در معرض IMS در مقایسه با مرغان تخم‌گذار در معرض MRS، Freqpreen به‌طور معنی‌داری افزایش‌یافته (P ≤ 0.017) و Durapreen به‌طور معنی‌داری طولانی‌تر (P ≤ 0.019) داشتند. در میان سه گروه در معرض IMS، گروه IML به‌طور معنی‌داری Freqpreen (P = 0.008) و Durapreen (P < 0.001) بالاتری نسبت به گروه IMM داشت.

اثرات اصلی صدا بر Freqpreen و Durapreen در D12 و D24 مشاهده شد. گروه‌های در معرض MRS در D12 و D24 همواره در مقایسه با گروه‌های در معرض NS و IMS با Freqpreen (P(sound) ≤ 0.017) و Durapreen (P(sound) ≤ 0.015) به‌طور معنی‌داری کمتر همراه بودند. گروه‌های در معرض IMS در D24 در مقایسه با گروه‌های در معرض NS با Freqpreen (P(sound) < 0.001) و Durapreen (P(sound) < 0.001) به‌طور معنی‌داری بالاتر مشخص می‌شدند (جدول 2).

جدول 2. فراوانی (n) و مدت (s) رفتار پرآرایی (n = 15)

یادداشت‌ها: اختصارات مانند جدول 1. a,b,c,d: میانگین‌هایی با حروف کوچک متفاوت در یک ستون نشان‌دهنده تفاوت‌های معنی‌دار (P ≤ 0.05) هستند. A,B,C: میانگین‌هایی با حروف بزرگ متفاوت در یک ستون نشان‌دهنده تفاوت‌های بسیار معنی‌دار (P ≤ 0.01) هستند.

فراوانی و مدت رفتار نوک‌زدن پر

نتایج ما نشان داد در D3 اثرات متقابل معنی‌دار S × D بر Freqpeck وجود داشت. صرف‌نظر از تراکم‌های نگهداری، گروه‌های در معرض IMS در D3 همواره Freqpeck به‌طور معنی‌داری کمتر از گروه‌های در معرض MRS داشتند (P < 0.001) و MRS همواره در مقایسه با NS و IMS با Freqpeck به‌طور معنی‌داری بالاتر همراه بود (P ≤ 0.039). در میان سه گروه در معرض NS، گروه NL در D3 با Freqpeck به‌طور معنی‌داری کمتر از دو گروه دیگر همراه بود (P ≤ 0.001)، با الگویی که هرچه تراکم کمتر، Freqpeck کمتر.

اثرات اصلی صدا بر Freqpeck و Durapeck در D3، D12 و D24 مشاهده شد. IMS نیز با Freqpeck (P(sound) < 0.001) و Durapeck (P(sound) ≤ 0.016) به‌طور معنی‌داری کمتر همراه بود، در حالی که MRS با Freqpeck (P(sound) ≤ 0.005) و Durapeck (P(sound) < 0.001) به‌طور معنی‌داری بالاتر ارتباط داشت.

تراکم نگهداری اثرات اصلی معنی‌داری بر Freqpeck در D24 و بر Durapeck در D3، D12 و D24 داشت. مرغان تخم‌گذار نگهداری‌شده در LD همواره در مقایسه با مرغان تخم‌گذار نگهداری‌شده در HD، Freqpeck (P(density) < 0.001) و Durapeck (P(density) ≤ 0.009) به‌طور معنی‌داری کمتری داشتند (جدول 3).

جدول 3. فراوانی (n) و مدت (s) رفتار نوک‌زدن پر (n = 15)

یادداشت‌ها: اختصارات و علائم آماری مانند جدول 2.

اثرات صدا و تراکم نگهداری بر جوامع باکتریایی سکوم

اطلاعات کلی توالی‌یابی

در این مطالعه، در مجموع 3,583,439 خوانش با کیفیت بالا از 54 نمونه محتویات مجرای سکوم تولید شد (به‌طور میانگین 66,360 خوانش برای هر نمونه) و 1,319 OTU به دست آمد که 26 شاخه را پوشش می‌داد. میانگین تعداد OTU برای هر نمونه 675 بود و 76 OTU هسته‌ای به‌طور پیوسته در همه نمونه‌ها شناسایی شد.

شکل 1. پروفایل‌های آرایه‌شناختی باکتری‌های سکوم در میان مرغان تخم‌گذار در معرض منابع مختلف صدا و نگهداری‌شده در تراکم‌های مختلف. (A) و (B) در سطح شاخه؛ (C) و (D) در سطح جنس. اختصارات: NS، صدای طبیعی؛ IMS، موسیقی بی‌کلام؛ MRS، صدای ترکیبی جاده؛ LD، تراکم پایین؛ MD، تراکم متوسط؛ HD، تراکم بالا.

تغییرات ترکیب آرایه‌شناختی در جوامع باکتریایی سکوم

پروفایل‌های آرایه‌شناختی اختصاص‌یافته نشان داد که در همه گروه‌های تیماری، باکتروئیدتس و فیرمیکیوتس با میانگین فراوانی به‌ترتیب 45.10 و 39.40 درصد بر جوامع باکتریایی سکوم غالب بودند و پس از آن‌ها اکتینوباکتریا (2.10 درصد)، تنریکیوتس (1.67 درصد) و پروتئوباکتریا (1.20 درصد) قرار داشتند. نتایج LEfSe نشان داد باکتری‌های جنس Lactobacillus (شاخه Firmicutes، رده Bacilli، راسته Lactobacillales، خانواده Lactobacillaceae) و گروه Ruminococcus torques در محتویات سکوم جمع‌آوری‌شده از مرغان تخم‌گذار در معرض IMS به‌طور معنی‌داری غنی شده بودند، در حالی که فراوانی نسبی باکتری‌های جنس‌های Bacteroides و Parabacteroides در شیرابه سکوم جمع‌آوری‌شده از مرغان تخم‌گذار در معرض MRS به‌طور معنی‌داری افزایش یافته بود. ساختار جامعه باکتریایی در سکوم مرغان تخم‌گذار در معرض NS با باکتری‌های غنی‌شده معنی‌دار در جنس Faecalibacterium مشخص می‌شد (P < 0.05 و امتیاز LDA > 4.0) (شکل‌های 1 و 2). در میان مرغان تخم‌گذار نگهداری‌شده در تراکم‌های مختلف، جنس‌های Faecalibacterium و Megamonas زیست‌نشانگرهای باکتریایی در سکوم مرغان تخم‌گذار نگهداری‌شده در LD بودند، در حالی که جنس‌های Ruminococcaceae UCG 005، Ruminococcaceae UCG 010 و گروه Lachnospiraceae NK4A136 در سکوم مرغان تخم‌گذار نگهداری‌شده در HD به‌طور معنی‌داری غنی شده بودند. باکتری‌های غنی‌شده معنی‌دار در جنس‌های گروه Rikenellaceae RC9 gut و Odoribacter با محتویات سکوم جمع‌آوری‌شده از مرغان تخم‌گذار نگهداری‌شده در MD ارتباط داشتند (P < 0.05 و امتیاز LDA > 2.5) (شکل 1 و شکل S3).

شکل 2. فراوان‌ترین آرایه‌های تفاضلی در محتویات گوارشی سکوم در گروه‌های تیماری مختلف. (A) باکتری‌های شاخص شناسایی‌شده با تحلیل تشخیصی خطی (LDA) با امتیاز LDA بزرگ‌تر از 4. (B) کلادوگرام نشان‌دهنده توزیع فیلوژنتیک تبارهای باکتریایی. دایره‌ها سطوح فیلوژنتیک از شاخه تا جنس را نشان می‌دهند و قطر هر دایره متناسب با فراوانی آن گروه است. اختصارات: NS، صدای طبیعی؛ IMS، موسیقی بی‌کلام؛ MRS، صدای ترکیبی جاده.

تنوع آلفا و بتای جوامع باکتریایی در محتویات سکوم

همه پوشش‌های Good بزرگ‌تر از 0.996 بودند که نشان می‌داد تنوع باکتریایی درون نمونه‌های محتویات گوارشی سکوم به‌اندازه کافی ثبت شده است. در همه شاخص‌های ارزیابی‌شده، نه اثرات اصلی معنی‌دار تراکم نگهداری و نه اثرات متقابل معنی‌دار S × D مشاهده شد. صدا اثرات اصلی معنی‌دار بر شاخص‌های Shannon (P(sound) = 0.009) و Simpson (P(sound) = 0.034) داشت و مرغان تخم‌گذار در معرض IMS مقادیر به‌طور معنی‌داری کمتر از مرغان تخم‌گذار در معرض NS و MRS نشان دادند، که بازتاب‌دهنده ساختار جامعه باکتریایی به‌طور معنی‌داری کم‌تنوع‌تر در محتویات گوارشی سکوم در اثر مواجهه با IMS بود (جدول S2). به‌طور همسو، محتویات سکوم جمع‌آوری‌شده از گروه IMS تعداد OTU نسبتاً کمتری (737 ± 13) نسبت به گروه NS (760 ± 13) و گروه MRS (762 ± 10) داشت.

علاوه بر این، NMDS مبتنی بر ناهمانندی‌های Bray-Curtis جدایی نمونه‌ها را میان گروه‌های مختلف نشان داد (شکل 3). ترکیب‌های جامعه باکتریایی محتویات گوارشی سکوم میان مرغان تخم‌گذار در معرض منابع مختلف صدا متمایز بود، در حالی که جدایی میان مرغان تخم‌گذار نگهداری‌شده در تراکم‌های مختلف به‌سختی قابل تشخیص بود.

شکل 3. تنوع بتای میکروبیوم سکوم که با نمودارهای مقیاس‌بندی چندبعدی غیرمتریک (NMDS) نشان داده شده است. (A و B) نمودارهای NMDS در میان گروه‌های در معرض منابع مختلف صدا و تراکم‌های مختلف نگهداری، به‌ترتیب. هر نقطه نماینده میکروبیوم سکوم یک فرد است. اختصارات: NS، صدای طبیعی؛ IMS، موسیقی بی‌کلام؛ MRS، صدای ترکیبی جاده؛ LD، تراکم پایین؛ MD، تراکم متوسط؛ HD، تراکم بالا.

پیش‌بینی عملکردهای مولکولی میکروبیوم‌های مجرای سکوم با PICRUSt انجام شد. میکروبیوم‌های سکوم با PICRUSt بیشتر تحلیل شدند تا عملکردهای بالقوه آن‌ها پیش‌بینی شود. در سطح 2 KEGG، باکتری‌های سکوم در مرغان تخم‌گذار در معرض NS و IMS فراوانی نسبی به‌طور معنی‌داری بالاتری از عملکردهای ژنی پیش‌بینی‌شده درگیر در مسیر پردازش اطلاعات محیطی انتقال غشایی (P = 0.001)، مسیرهای متابولیکی متابولیسم لیپید (P = 0.044) و تجزیه زیستی و متابولیسم زنوبیوتیک‌ها (P = 0.009) نسبت به مرغان تخم‌گذار در معرض MRS داشتند. در همین حال، مسیرهای انتقال و کاتابولیسم (فرایندهای سلولی) (P < 0.001)، تاخوردگی، دسته‌بندی و تخریب (پردازش اطلاعات ژنتیکی) (P = 0.001)، و همچنین مسیرهای متابولیکی زیست‌ساخت سایر متابولیت‌های ثانویه (P = 0.003)، زیست‌ساخت و متابولیسم گلیکان (P < 0.001) و متابولیسم کوفاکتورها و ویتامین‌ها (P = 0.009) در گروه‌های MRS به‌طور معنی‌داری غنی شده بودند (شکل 4). برای تراکم نگهداری، تفاوتی در غنی‌شدن مسیرهای مختلف KEGG در سطح 2 در مرغان تخم‌گذار سبزپوسته شیان‌دائو وجود نداشت (شکل S4).

شکل 4. پیش‌بینی عملکرد میکروبیوتای سکوم مرغان تخم‌گذار سبزپوسته در گروه‌های مختلف. (A) حاشیه‌نویسی KEGG در سطح 2 تحت مواجهه‌های مختلف با صدا؛ (B) تفاوت‌ها در غنی‌شدن مسیرهای مختلف KEGG در سطح 2. NS، صدای طبیعی؛ IMS، موسیقی بی‌کلام؛ MRS، صدای ترکیبی جاده. داده‌ها به‌صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین (SEM) ارائه شده‌اند. نوار‌های خطا خطاهای استاندارد را نشان می‌دهند. حروف کوچک و بزرگ متفاوت متصل به میله‌ها به‌ترتیب تفاوت‌های معنی‌دار (P ≤ 0.05، P ≤ 0.01) را نشان می‌دهند.

بحث

اثرات تراکم‌ها و صداهای مختلف نگهداری بر استرس فیزیولوژیک

نتایج مطالعه حاضر ارتباط LD و IMS را با تخفیف استرس فیزیولوژیک در مرغان تخم‌گذار سبزپوسته شیان‌دائو نشان داد؛ شاهد آن سطوح سرمی ACTH و CORT به‌طور معنی‌داری کمتر در مقایسه با به‌ترتیب HD و MRS بود. فعال‌سازی محور HPA و در نتیجه افزایش ترشح ACTH و CORT عموماً در پاسخ‌های استرسی دخیل است و بر عملکرد حیوانات اثر منفی می‌گذارد (Scanes, 2016). تعدادی از مطالعات با هدف مقابله با تأثیرات نامطلوب استرس ناشی از HD بر عملکرد تولیدی مرغ انجام شده است. برای مثال، نشان داده شده است که مکمل‌سازی جیره با کروم آلی (Mirfendereski & Jahanian, 2015)، 25-هیدروکسی‌کوله‌کلسیفرول (Wang و همکاران، 2020)، برنج شلتوک جوانه‌زده در مرغان تخم‌گذار (Incharoen, Roytrakul & Likittrakulwong, 2021) و آلفا-لیپوئیک اسید در جوجه‌های گوشتی (Ma و همکاران، 2020) سطح CORT پلاسمای ناشی از HD را کاهش می‌دهد و بدین ترتیب عملکرد تولیدی حیوانات را بهبود می‌بخشد. در همین حال، نشان داده شد مواجهه مرغان تخم‌گذار با موسیقی کلاسیک در کاهش سطوح استرس مؤثر است؛ شاهد آن کاهش معنی‌دار نسبت هتروفیل به لنفوسیت (H/L) بود (Dávila و همکاران، 2011). در مجموع، نتایج ما نشان داد LD و مواجهه با IMS ممکن است به‌عنوان مدیریت‌های عملی برای کاهش پاسخ‌های مرتبط با استرس و افزایش عملکرد و بازده اقتصادی در مرغان تخم‌گذار قفسی بیشتر بررسی شوند.

همچنین دریافتیم که تفاوت‌های معنی‌داری در سطوح سرمی دو شاخص استرس بین مرغان تخم‌گذار در معرض NS و مرغان تخم‌گذار در معرض IMS وجود نداشت، هرچند دومی کمترین سطوح سرمی ACTH و CORT را در نقاط نمونه‌برداری مختلف نشان داد. این نتایج نشان داد که مواجهه با IMS استرس اضافی بر مرغان تخم‌گذار وارد نکرده است. علاوه بر این، در پایان آزمایش، تفاوت‌های معنی‌داری در سطوح سرمی ACTH و CORT بین مرغان تخم‌گذار نگهداری‌شده در MD (که تراکم نگهداری مورد قبول عمومی در چین است) و LD مشاهده نشد، که نشان می‌دهد تراکم نگهداری متعارف کنونی در چین (متناظر با MD در آزمایش ما) در محدوده توان سازگاری مرغان تخم‌گذار بود و بدون ایجاد استرس زیان‌بار در مرغان تخم‌گذار سبزپوسته شیان‌دائو قرار داشت.

اثرات تراکم‌ها و صداهای مختلف نگهداری بر رفتارها

نتایج ما نشان داد LD و IMS با افزایش رفتار پرآرایی و کاهش رفتار نوک‌زدن پر همراه بودند.

پرآرایی رفتاری برای خودآرایی و نگهداری پر است. مرغ‌ها تقریباً 13 درصد از وقت روزانه خود را صرف پرآرایی می‌کنند (Dawkins, 1989). پرآرایی در مرغ‌های ماده به‌عنوان رفتاری مرتبط با آسایش تفسیر شده است (Mollenhorst و همکاران، 2005؛ Iyasere و همکاران، 2022؛ Onbaşılar, 2022) و افزایش رفتار پرآرایی با کاهش اثرات منفی تنش گرمایی در جوجه‌های گوشتی مرتبط بود (Mohammed و همکاران، 2018، 2022). با این حال، پژوهشگرانی هستند که تردید دارند که آیا افزایش بروز رفتار پرآرایی نشان‌دهنده وضعیت راحت‌تر است، یا تمایل بیشتر به جست‌وجوی آسایش (O’Connor و همکاران، 2011)، یا نشانه کلیشه‌ای مرتبط با استرس (Elston و همکاران، 2000). در مطالعه ما، اثرات اصلی معنی‌دار صدا بر رفتار پرآرایی (فراوانی و مدت) در D12 و D24 مشاهده شد و مرغان تخم‌گذار در معرض IMS بیشترین و طولانی‌ترین رفتار پرآرایی را نشان دادند. به‌طور مشابه، در پژوهشی اخیر، تحریک با موسیقی روی کبکچه‌های 10 هفته‌ای رومن سفید (10 ساعت در روز به مدت 7 روز متوالی) به‌طور معنی‌داری رفتار پرآرایی بیشتر و رفتار نوک‌زدن پر کمتری را برانگیخت که بیانگر وضعیت کم‌استرس‌تر بود (Zhao و همکاران، 2023). بر اساس نتایج ما از سطوح سرمی ACTH و CORT در مرغان تخم‌گذار در معرض IMS، نتیجه گرفتیم که افزایش فعالیت پرآرایی ناشی از تیمار IMS نشان‌دهنده وضعیت راحت‌تر و کم‌استرس‌تر در مرغان تخم‌گذار بود.

رفتار نوک‌زدن پر مسئله جدی رفاه حیوانی و عامل خطر اصلی برای آسیب پر در مرغ‌های ماده است. گزارش شده است که نوک‌زدن پر تحت تأثیر تراکم نگهداری (Zepp و همکاران، 2018) و سطح بالای نویز (Drake, Donnelly & Dawkins, 2010؛ Gilani, Knowles & Nicol, 2013) قرار دارد. در این مطالعه، دریافتیم HD و MRS با رفتار نوک‌زدن پر پرتکرارتر همراه بودند که با افزایش همزمان سطوح سرمی ACTH و CORT سازگار بود. رابطه مثبت مشاهده‌شده بین فراوانی نوک‌زدن پر و تراکم نگهداری با پژوهش‌های پیشین در بوقلمون‌های ماده (Jhetam و همکاران، 2022) و جوجه‌های ماده لگهورن سفید (Hofmann و همکاران، 2021) هم‌راستاست. پژوهش اندکی درباره تأثیر موسیقی بر رفتار نوک‌زدن پر طیور وجود دارد. Cabaral, Untalan & Rieta (2017) اشاره کردند که انواع مختلف موسیقی رفتار نوک‌زدن پر را در بلدرچین‌های ژاپنی برنمی‌انگیزد. Zhao و همکاران (2023) دریافتند کبکچه‌های 10 هفته‌ای رومن سفید در معرض موسیقی کلاسیک نسبت به گروه شاهد رفتارهای نوک‌زدن پر کمتری دارند. این یافته‌ها با تأثیرات مثبتی که در مطالعه حاضر مشاهده کردیم سازگار است. درباره اثرات سودمند LD و IMS در کاهش رفتار نوک‌زدن پر، ما فرض کردیم که تأثیرات آن‌ها افزایشی بود، زیرا کمترین Freqpecking و Durapecking در D24 در مرغان تخم‌گذاری مشاهده شد که هم در معرض LD و هم IMS قرار داشتند (گروه IML).

در مجموع، نتایج ما نشان داد LD و IMS به‌طور بالقوه با مزایای رفتاری در مرغان تخم‌گذار مرتبط بودند که ممکن است برای بهبود رفاه مرغان تخم‌گذار سبزپوسته شیان‌دائو بررسی شوند.

اثرات تراکم‌ها و صداهای مختلف نگهداری بر جوامع باکتریایی سکوم

همسو با گزارش‌های پیشین در مرغ، نتایج ما در مرغان تخم‌گذار سبزپوسته شیان‌دائو تأیید کرد که میکروبیوتای محتویات سکوم تحت سلطه فیرمیکیوتس، باکتروئیدتس، اکتینوباکتریا، تنریکیوتس و پروتئوباکتریا بود (Hu و همکاران، 2020). تراکم‌های مختلف نگهداری و مواجهه با صدا جابه‌جایی آرایه‌شناختی در جوامع باکتریایی سکوم القا کرد. مستقل از تراکم‌های نگهداری، جوامع باکتریایی سکوم در مرغان تخم‌گذار در معرض IMS بسیار کم‌تنوع‌تر از مرغان تخم‌گذار در معرض NS و MRS بود. در مورد تنوع بتا، جوامع باکتریایی سکوم در پاسخ به منابع مختلف صدا، و نه تراکم‌های مختلف نگهداری، تمایل به جدا‌شدن داشتند.

نتایج ما نشان داد مواجهه با موسیقی دو شاخه غالب را به سمت غنی‌شدن فیرمیکیوتس با کاهش همراه باکتروئیدتس تغییر داد. گزارش‌های پیشین نشان دادند که میکروبیوتای سکوم مرغان بالغ (مرغ‌های Lohmann Brown Light) عمدتاً از نمایندگان فیرمیکیوتس و باکتروئیدتس با تعداد تقریباً برابر هر دو شاخه تشکیل شده بود (Videnska و همکاران، 2014). در مطالعه حاضر، نسبت فیرمیکیوتس به باکتروئیدتس (F/B) در بیشتر گروه‌ها حدود 1.00 بود، به‌جز گروه‌های تحت مواجهه با MRS (0.66) یا نگهداری‌شده در HD (0.86). کاهش معنی‌دار نسبت F/B در محتویات مدفوع مرغان تخم‌گذار دچار تنش گرمایی نیز مشاهده شد (Zhu و همکاران، 2018). با این حال، Wang و همکاران (2021) افزایش معنی‌دار نسبت F/B ناشی از HD را در مرغان تخم‌گذار گزارش کردند. ما پیشنهاد کردیم که ناهمخوانی میان نتایج مطالعات مختلف ممکن است به تفاوت‌ها در گونه مرغ، منشأ استرس، مرحله فیزیولوژیک مرغ‌ها، رژیم‌های غذایی، محیط و روش توالی‌یابی مربوط باشد.

تحلیل بیشتر نشان داد Lactobacillus از شاخه فیرمیکیوتس جنس مورد ترجیح در محتویات سکوم مرغان تخم‌گذار در معرض IMS بود. گونه‌های Lactobacillus سطح pH روده را کاهش دادند، از طریق تولید استات، لاکتات، فومارات، هیدروژن پراکسید و باکتریوسین‌ها از رشد عوامل بیماری‌زا جلوگیری کردند و اثرات سودمندی بر میزبان اعمال کردند (Muir, Bryden & Husband, 2000). مطالعات در مرغان تخم‌گذار نشان داد که افزایش معنی‌دار حضور گونه‌های Lactobacillus در سکوم و ایلئوم در اثر تجویز پروبیوتیک‌ها (L. acidophilus) ارتباط نزدیکی با کاهش باکتری‌های بالقوه زیان‌آور مانند E. coli، کلستریدیا و استافیلوکوک‌ها داشت (Forte و همکاران، 2016). افزایش معنی‌دار تعداد لاکتوباسیل‌ها و بیفیدوباکتری‌ها در ایلئوم و سکوم جوجه‌ها در اثر درمان با پری‌بیوتیک‌ها و پروبیوتیک‌ها با کاهش تعداد E. coli همراه بود که بیانگر میکروبیوتای روده متعادل است (Li, Zhao & Wang, 2009). غنی‌شدن معنی‌دار این دو باکتری پروبیوتیک در ژژنوم با مرغ‌هایی که وزن بدن بالا و سطوح بالاتر سیتوکین‌های ضدالتهابی داشتند مرتبط بود، که بیانگر بهبود عملکرد رشد و تخفیف التهاب روده است (Zhang و همکاران، 2022). در جوجه‌های گوشتی، افزایش فراوانی لاکتوباسیل‌ها و بیفیدوباکتری‌ها در سکوم با افزایش وزن به‌طور معنی‌دار بیشتر همراه بود (Li و همکاران، 2017). در سایر حیوانات، Bravo و همکاران (2011) دریافتند L. rhamnosus (از جنس لاکتوباسیل‌ها) CORT ناشی از استرس و رفتار مرتبط با اضطراب و افسردگی را در موش‌ها کاهش داد و نتایج Liang و همکاران (2015) نیز نشان داد L. helveticus NS8 (از جنس لاکتوباسیل‌ها) به سطوح پایین‌تر ACTH و CORT پلاسما و بهبود اختلال عملکرد رفتاری و شناختی ناشی از استرس مزمن مهار در موش‌های صحرایی انجامید. در مطالعه ما، می‌یابیم که مرغان تخم‌گذار در معرض IMS سطح هورمون‌های استرس را افزایش ندادند، اما رفتار پرآرایی را به‌طور معنی‌داری افزایش و رفتار نوک‌زدن پر را کاهش دادند. حدس زده می‌شود که این نتایج ممکن است به غنی‌شدن Lactobacillus در روده تیمار IMS مربوط باشد. Lactobacillus غنی‌شده معنی‌دار در سکوم مرغان تخم‌گذار سبزپوسته شیان‌دائو در معرض IMS ممکن است نشان‌دهنده محیط سکومی سالم‌تر باشد.

گروه جنس Ruminococcus torques زیست‌نشانگر باکتریایی دیگری در پاسخ به مواجهه با IMS بود. در مطالعه‌ای پیشین، Ruminococcus torques تولیدکننده بوتیرات، متعلق به خانواده Lachnospiraceae، پس از مکمل‌سازی با پری‌بیوتیک آرابینوکسیلان‌های کوتاه‌زنجیر در سکوم جوجه‌های گوشتی به‌طور معنی‌داری غنی شد که با افزایش معنی‌دار غلظت SCFAهای سکوم (عمدتاً استات، پروپیونات، بوتیرات و لاکتات) همراه بود (Yacoubi و همکاران، 2018). شناخته شده بود که اعضای Lachnospiraceae و Ruminococcaceae قادرند بسترهای مقاوم (سلولز، همی‌سلولز و نشاسته) را که در غیر این صورت برای میزبان غیرقابل هضم بودند تجزیه کنند (Biddle و همکاران، 2013) و بدین ترتیب این ترکیبات را به SCFAها تبدیل می‌کردند که سپس جذب می‌شدند و میزبان از آن‌ها به‌عنوان انرژی استفاده می‌کرد.

علاوه بر این، نتایج یک مطالعه درون‌تنی نشان داد که یک محیط نسبتاً اسیدی (pH 5.5) به‌شدت تخمیر بوتیروژنیک را ترجیح می‌دهد که با افزایش جمعیت باکتری‌های تولیدکننده بوتیرات و کاهش رشد گونه‌های Bacteroides همراه بود (Walker و همکاران، 2005)، که با افزایش معنی‌دار نسبت F/B مشاهده‌شده در مرغان تخم‌گذار در معرض IMS سازگار بود. از این رو، غنی‌شدن معنی‌دار باکتری‌های جنس Lactobacillus و گروه Ruminococcus torques ناشی از IMS به حفظ محیط اسیدی‌تر در سکوم، بهبود توان میزبان در تجزیه مواد گیاهی پیچیده و ارتقای سلامت سکوم با پتانسیل افزایش عملکرد مرغان تخم‌گذار کمک کرد. این نتایج با عملکردهای مولکولی پیش‌بینی‌شده باکتری‌های سکوم در مرغان تخم‌گذار در معرض IMS همخوانی داشت که با مسیرهای متابولیسم متعدد به‌طور معنی‌داری تقویت‌شده مشخص می‌شدند و بیانگر محیط متابولیکی فعال بودند. در مجموع، این جابه‌جایی‌های آرایه‌شناختی در پاسخ به موسیقی از فرض ما حمایت کرد که موسیقی، به‌عنوان عاملی برای غنی‌سازی شنیداری، ممکن است در شکل‌دهی ساختار بهتر جامعه باکتریایی سکوم در مرغان تخم‌گذار نقش مهمی ایفا کند.

در مورد تراکم‌های نگهداری، آن‌ها بر تنوع و ساختار جامعه جمعیت‌های باکتریایی سکوم در مرغان تخم‌گذار سبزپوسته شیان‌دائو تأثیراتی داشتند، هرچند به درجه کمتری از IMS. دو جنس از فیرمیکیوتس، Megamonas (LDA = 3.5) و Faecalibacterium (LDA = 4.0)، به‌عنوان زیست‌نشانگرهای جوامع باکتریایی سکوم در مرغان تخم‌گذار نگهداری‌شده در LD شناسایی شدند. Megamonas که عمدتاً در میکروبیوتای سکوم مرغ‌ها حضور دارد، احتمالاً یکی از تولیدکنندگان اصلی پروپیونات در میان فیرمیکیوتس بود (Sergeant و همکاران، 2014). Faecalibacterium تولیدکننده شناخته‌شده بوتیرات بود و تولید بوتیرات را بر پروپیونات در محتویات سکوم مرغ ترجیح می‌داد (Rowland و همکاران، 2018). غلظت‌های به‌طور معنی‌داری افزایش‌یافته اسیدهای استیک و بوتیریک سکوم در مرغ‌ها با افزایش توان‌های ضدمیکروبی در برابر عوامل بیماری‌زای روده‌ای مرتبط بود (Aljumaah و همکاران، 2020). جمعیت‌های غنی‌شده باکتری‌های تولیدکننده بوتیرات و پروپیونات می‌توانند سلامت سکوم را بهبود دهند.

نتایج ما نشان داد فراوانی نسبی Lactobacillus در جوامع باکتریایی سکوم در پاسخ به افزایش تراکم نگهداری روند کاهشی نشان داد. به‌طور مشابه، کاهش معنی‌دار شمار Lactobacillus در محتویات روده در جوجه‌های گوشتی 42 روزه نگهداری‌شده در تراکم بالا گزارش شد (Cengiz و همکاران، 2015). تغییرات ترکیب باکتریایی سکوم مرتبط با HD با باکتری‌های غنی‌شده معنی‌دار از دو جنس Ruminococaceae UCG 005 و Ruminococaceae UCG 010 بازتاب یافت. داده‌های محدود به‌دست‌آمده در موش‌های صحرایی نشان داد که اولی باکتری زیان‌آوری بود که ارتباط نزدیکی با استرس اکسیداتیو داشت (Qin و همکاران، 2022)، در حالی که اطلاعات عملکردی دقیقی برای این دو باکتری در مرغ‌ها در دسترس نبود.

در مجموع، نتایج مطالعه حاضر امکان بهبود میکروبیوتای روده را از طریق راهبردهای مواجهه با موسیقی و دستکاری تراکم در مرغان تخم‌گذار سبزپوسته شیان‌دائو برجسته کرد.