فایل PDF مقاله را اینجا دانلود کنید.
۱. مقدمه
سنگدان مرغ بخشی از دستگاه گوارش مرغ است که «معده ماهیچه‌ای» نیز نامیده می‌شود و ۲٫۵ درصد لاشه مرغ را تشکیل می‌دهد [1]. بر اساس کتاب «خلاصه مواد دارویی» (سلسله مینگ، قرن شانزدهم)، سنگدان مرغ دارای پروتئین و آهن بالاست، می‌تواند ماده اولیه تولید دارو (Gigeriae galli endothelium corneum) باشد و اثرات گوارشی، ضدتهوع و ملین دارد [2]. در چین، تولید سالانه سنگدان مرغ در سال ۲۰۲۰ به ۰٫۲۷ میلیون تن رسید و بر اساس گزارش OECD-FAO [3]، انتظار می‌رود تا سال ۲۰۲۸ به ۱ میلیون تن افزایش یابد. سنگدان مرغ یکی از فرآورده‌های جانبی خوراکی صنعت طیور در سراسر جهان است. این ماده به دلیل ارزان‌تر بودن نسبت به گوشت مرغ، منبع اقتصادی پروتئین و سایر مواد مغذی است. افزون بر این، مصرف سنگدان مرغ برای سلامت انسان مفید دانسته می‌شود، زیرا سنگدان‌ها اسیدهای چرب اشباع کل کمتر و اسیدهای چرب تک‌غیراشباع کل بیشتری دارند [4]. سنگدان مرغ معمولاً پس از تفت دادن با سس مستقیماً مصرف می‌شود تا نرخ بهره‌برداری از فرآورده‌های جانبی افزایش یابد و آلودگی محیط‌زیست کاهش پیدا کند [5].
سنگدان مرغ اندام گوارشی مرغ است و چون مرغ دندان ندارد، برای خرد کردن و هضم غذا با کمک چین‌های سنگدان به عضلات قوی به‌عنوان نیروی محرکه نیاز دارد. به‌طور کلی، هرچه بار فعالیت بدنی بیشتر باشد، عضله سخت‌تر است [6]. دلیل این پدیده آن است که پروتئین‌ها در چنین عضلاتی هنگام فعالیت شدید به برقراری پیوندهای عرضی کووالانسی گرایش دارند. این امر بافت همبند قوی و متراکمی ایجاد می‌کند که از فیبرهای عضلانی در برابر آسیب ناشی از شرایط فرآوری خارجی (مانند پخت) محافظت می‌کند و به سخت شدن عضله می‌انجامد، که برای جویدن و هضم مناسب نیست [7]. بنابراین، نرم‌سازی مناسب بافت همبند و تجزیه متوسط فیبرهای عضلانی می‌تواند نرمی عضله را به‌طور مؤثر بهبود دهد. تاکنون مطالعات نسبتاً کمی به‌صورت نظام‌مند روی سنگدان انجام شده است. از آنجا که ترکیب پایه سنگدان شبیه عضله است، نرمی سنگدان را می‌توان با روش‌های نرم‌سازی عضله بهبود داد.
در حال حاضر، فراصوت، به‌عنوان یک روش فرآوری فیزیکی غیرحرارتی، رایج‌ترین و مؤثرترین روش فیزیکی نرم‌سازی است و به‌طور گسترده برای نرم‌سازی گوشت گاو [8]، خوک [9] و خرگوش [10] به کار رفته است. برای مثال، یئونگ و هوانگ [11] مغز راسته خوک را با فراصوت پرشدت تیمار کردند و نیروی برشی نمونه‌های تیمارشده نسبت به نمونه‌های بدون فراصوت ۱۲٫۱ درصد کاهش یافت. چانگ، وانگ، تانگ و ژو [12] دریافتند که تیمار فراصوت ماهیچه نیم‌وتری گاو (semitendinosus) به مدت ۳۰ دقیقه می‌تواند اندومیزیوم را تا حدی آسیب بزند، ضخامت پریمیزیوم را کاهش دهد، پیوندهای عرضی کووالانسی کلاژن را تضعیف کند و استحکام مکانیکی بافت همبند را بکاهد، که نرمی گوشت گاو semitendinosus را به‌طور مؤثری بهبود داد. با این حال، گزارش‌های اندکی درباره بهبود نرمی سنگدان مرغ با تیمار فراصوت وجود دارد.
فراصوت فناوری نرم‌سازی فیزیکی کارآمد، ایمن و غیرسمی است که می‌تواند انرژی الکتریکی را به انرژی مکانیکی تبدیل کند [13]. انرژی مکانیکی از طریق محیط انتقال فراصوت منتقل می‌شود و اثرات مکانیکی، حرارتی و کاویتاسیون ایجاد می‌کند [14,15]. اثر کاویتاسیون عامل اصلی واکنش‌های فیزیکوشیمیایی عضله است و می‌تواند با از بین بردن برهمکنش‌های ضعیف بین مولکولی (مانند پیوندهای هیدروژنی و نیروهای واندروالس) نرمی را افزایش دهد، که به تخریب بافت عضله (شکست فیبر عضلانی) می‌انجامد [16]. همچنین میکروجت و میکروتلاطم ناشی از کاویتاسیون فراصوت می‌تواند در اندومیزیوم و پریمیزیوم ترک ایجاد کند، ساختار فیزیکی فیبر کلاژن را تخریب کند، تجزیه آنزیم‌های عضله را افزایش دهد و درجه پیوند عرضی پیریدین در کلاژن را کاهش دهد، که نقش مثبتی نیز در بهبود نرمی عضله دارد [17]. هدف پژوهش حاضر بررسی سازوکار اثر تیمارهای فراصوت بر نرمی سنگدان مرغ از طریق عملکرد فیبر عضلانی و ویژگی‌های بافت همبند بود. افزون بر این، شرایط بهینه فراصوت انتخاب شد تا پشتوانه نظری و راهنمای فنی برای کاربرد گسترده سنگدان مرغ در صنایع غذایی فراهم شود.
۲.مواد و روش‌ها
۲٫۱. مواد شیمیایی
اتیلن‌دی‌آمین تترااستیک اسید (EDTA)، سدیم آزید، KH₂PO₄، K₂HPO₄، MgCl₂ و سیریوس قرمز از شرکت شیمیایی سیگما (سنت‌لوئیس، میزوری، آمریکا) خریداری شد. سایر مواد شیمیایی از شرکت Wantai Biomedicals (هاربین، چین) تهیه شد و دست‌کم درجه تحلیلی داشتند.
۲٫۲. آماده‌سازی نمونه
۲٫۰ کیلوگرم سنگدان مرغ (۱۲ ساعت پس از کشتار؛ مرغ آربور ایکرز پرورش‌یافته به مدت ۵۰ روز با وزن حدود ۲٫۰ کیلوگرم و وزن هر سنگدان حدود ۳۰ گرم) از سوپرمارکت Haoyouduo (هاربین، هیلونگجیانگ) خریداری شد و با کیسه یخ به‌سرعت به آزمایشگاه منتقل شد (دمای سنگدان‌ها حدود ۴ درجه سانتی‌گراد نگه داشته شد). پوست زرد و چربی سطح سنگدان‌ها جدا شد، با آب تمیز شسته شد و در یخچال ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. هر سنگدان در کیسه زیپ‌دار جداگانه قرار داده شد و برای تیمار فراصوت (۳۰ کیلوهرتز) کاملاً در آب مقطر غوطه‌ور شد. برای تیمارهای فراصوت از حمام فراصوت (شرکت Nanjing Xianou، نانجینگ، چین) استفاده شد. نتایج آزمایش‌های مقدماتی نشان داد شرایط نسبتاً مناسب نرم‌سازی چنین است: توان فراصوت ۵۰۰ وات/۶۰۰ وات (شکل S1، مواد تکمیلی)، زمان فراصوت ۲۰ دقیقه/۳۰ دقیقه (شکل S2، مواد تکمیلی) و حالت متناوب فراصوت ۳ ثانیه/۳ ثانیه (شکل S3، مواد تکمیلی). شدت‌های فراصوت بر اساس روش مالیک و سایینی [18] اندازه‌گیری شد و شدت واقعی توان‌های ۵۰۰ و ۶۰۰ وات به‌ترتیب ۲٫۰۹ و ۲٫۴۶ وات بر سانتی‌متر مربع بود. بنابراین نمونه‌ها با تیمارهای مختلف فراصوت (۵۰۰ وات/۲۰ دقیقه، ۵۰۰ وات/۳۰ دقیقه، ۶۰۰ وات/۲۰ دقیقه، ۶۰۰ وات/۳۰ دقیقه، ۳ ثانیه/۳ ثانیه) تیمار شدند تا بهترین ترکیب نرم‌سازی با فراصوت انتخاب شود. نمونه‌های گروه شاهد با فراصوت تیمار نشدند.
۲٫۳. ریزساختار
ریزساختار سنگدان‌ها با میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) (مدل S-3400N؛ هیتاچی، توکیو، ژاپن) مشاهده شد. روش تعیین ریزساختار از لی و همکاران [19] اقتباس شد. نمونه‌ها با تیغ دولبه به ابعاد ۰٫۵ × ۰٫۵ × ۰٫۵ سانتی‌متر مکعب بریده شدند و به مدت ۲ ساعت با گلوتارآلدهید در بافر فسفات (pH = 7٫2) تثبیت شدند. نمونه‌ها به مدت ۱ ساعت شسته شدند و با شیب غلظتی الکل آبگیری شدند. نمونه‌های خشک‌شده روی نوار چسب دووجه رسانا قرار گرفتند و با دستگاه پوشش‌دهی آلیاژ طلا–پالادیم (شرکت Bal-Tec، منچستر، نیوهمپشایر، آمریکا) پوشش داده شدند. ولتاژ شتاب‌دهنده SEM برابر ۵ کیلوولت و بزرگنمایی ۲۰۰۰ برابر بود.
۲٫۴. نیروی برشی
روش تعیین نیروی برشی وارنر–براتزلر با اندکی تغییر از روش ویلر، شکلفورد و کوهمارایه [20] اقتباس شد. نمونه‌ها در کیسه‌های پلاستیکی دربسته قرار گرفتند و در حمام آب (Fisher Scientific® مدل Isotemp 215) پخته شدند تا دمای داخلی مرکز هندسی به ۷۲ ± ۱ درجه سانتی‌گراد برسد. نیروی برشی نمونه (۲٫۰۰ × ۱٫۵۰ × ۱٫۵۰ سانتی‌متر مکعب) با دستگاه بافت‌سنج (Stable Micro System، مدل TA: XT2I، انگلستان) اندازه‌گیری شد. سرعت پیش‌آزمون ۵٫۰۰ میلی‌متر بر ثانیه و سرعت آزمون ۲٫۰۰ میلی‌متر بر ثانیه تنظیم شد. بازوی نیرو ۳۰٫۰ کیلوگرم، مسافت ۱ سانتی‌متر، فاصله زمانی تیغه برای اندازه‌گیری مجدد همان نمونه ۵٫۰۰ ثانیه (دو بار فشار) و نیروی آغازین ۲۰٫۰ گرم بود.
۲٫۵. شاخص قطعه‌قطعه‌شدن میوفیبریل
MFI نمونه‌ها بر اساس روش‌های توصیف‌شده توسط کالر، پاریش جونیور، اسمیت و کراس [21] تعیین و تحلیل شد. بافت عضله در نیتروژن مایع پودر شد و ۰٫۵ گرم از بافت پودرشده به مدت ۱ دقیقه در ۳۰ میلی‌لیتر بافر فسفات ۲۵ میلی‌مولار (حاوی پتاسیم کلرید ۰٫۱ مولار، اتیلن‌دی‌آمین تترااستیک اسید ۱ میلی‌مولار، pH ۷٫۰) همگن شد. سوسپانسیون برای حذف بافت همبند صاف شد و باقی‌مانده با ۱۰ میلی‌لیتر بافر فسفات ۲۵ میلی‌مولار شسته شد. سپس صافی‌شده به مدت ۱۵ دقیقه در ۱۰۰۰ × g و دمای ۴ درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد، رسوب در ۱۰ میلی‌لیتر بافر فسفات دوباره معلق شد و مجدداً سانتریفیوژ گردید. این مرحله دو بار دیگر تکرار شد و رسوب نهایی در محلول بافر معلق شد. غلظت پروتئین به ۰٫۵ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر رقیق شد و جذب آن با اسپکتروفتومتر در ۵۴۰ نانومتر (UV 6100، شرکت Jinan Hepu Instrument Equipment، شاندونگ، چین) اندازه‌گیری شد. MFI از ضرب مقادیر خوانده‌شده در ۲۰۰ محاسبه شد.
۲٫۶. ساختار بافت‌شناختی
بافت‌ها (۰٫۵ × ۰٫۵ × ۰٫۵ سانتی‌متر مکعب) به‌ترتیب در دستگاه آبگیری بسته خودکار بافت TSJ-Q و دستگاه قالب‌گیری BMJ-III (هر دو از شرکت Zhongwei Electronic Instrument، جیانگسو، چین) قرار داده شدند و در امتداد برش طولی به برش‌های ۱۰ میکرومتری تقسیم شدند. ساختار بافت‌شناختی بر اساس روش فلینت و پیکرینگ [22] ارزیابی شد. تصاویر با میکروسکوپ Olympus CX33 (شرکت Jinan Jiwei Medical Instrument، شاندونگ، چین) با بزرگنمایی ۴ برابر تهیه شدند. پس از مشاهده ساختار بافت‌شناختی، قطر فیبر عضلانی و ضخامت پریمیزیوم با نرم‌افزار ImageJ اندازه‌گیری و محاسبه شد.
۲٫۷. استحکام مکانیکی
استحکام مکانیکی بافت همبند با روش نیشیمورا، هاتوری و تاکاهاشی [23] و با دستگاه بافت‌سنج (Stable Micro System، مدل TA: XT2I، انگلستان) تعیین شد. نمونه‌ها به قطعاتی با ابعاد ۱٫۰ × ۱٫۰ × ۱٫۵ سانتی‌متر مکعب بریده شدند و استحکام مکانیکی بافت همبند قالب‌گیری‌شده در آکریل‌آمید با بافت‌سنج اندازه‌گیری شد. سرعت پیش‌آزمون ۵٫۰۰ میلی‌متر بر ثانیه، سرعت آزمون ۲٫۰۰ میلی‌متر بر ثانیه، بازوی نیرو ۳۰٫۰ کیلوگرم و مسافت ۵٫۰۰ میلی‌متر بود.
۲٫۸. پیریدینولین هیدروکسی‌لیزین و پیریدینولین لیزین
سنگدان وزن و خرد شد و نمونه با ۴ برابر حجم PBS (۰٫۰۱ مول بر لیتر، pH = 7٫4) با همگن‌ساز (Lue Shen Instrument Equipment، شانگهای، چین) له شد. همگنای حاصل به مدت ۲۰ دقیقه با سرعت ۲۵۰۰ دور بر دقیقه سانتریفیوژ شد و محلول رویی برای آزمون برداشته شد. چاهک‌های استاندارد و چاهک‌های نمونه به‌ترتیب روی پلیت تعیین شدند. چاهک‌های استاندارد با غلظت‌های مختلف مواد استاندارد (۵۰ میکرولیتر) پر شدند. چاهک‌های نمونه با ۴۰ میکرولیتر رقیق‌کننده نمونه و سپس ۱۰ میکرولیتر نمونه مورد آزمون پر شدند. معرف‌های نشان‌دارشده با آنزیم (۱۰۰ میکرولیتر) به چاهک‌های استاندارد و نمونه اضافه شد، سپس پلیت دربندی شد و به مدت ۶۰ دقیقه در ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. پس از ۵ بار شست‌وشوی مکرر، ۵۰ میکرولیتر از عوامل رنگ‌زای A و B به هر چاهک اضافه شد. پس از ظهور رنگ در ۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه (محافظت‌شده از نور)، مقدار OD هر چاهک بلافاصله در ۴۵۰ نانومتر اندازه‌گیری شد.
۲٫۹. محتوای کلاژن و حلالیت حرارتی
برای برآورد کل کلاژن، حدود ۳۰۰ میلی‌گرم از نمونه‌های خشک‌شده با انجماد به‌طور تصادفی انتخاب و در ۱۰ میلی‌لیتر هیدروکلریک اسید ۶ مولار به مدت ۱۶ ساعت در ۱۱۰ درجه سانتی‌گراد هیدرولیز شد. محتوای هیدروکسی‌پرولین با روش توصیف‌شده توسط وانگ و همکاران [24] اندازه‌گیری شد. مقدار هیدروکسی‌پرولین تعیین و با ضریب ۷٫۲۵ به محتوای کلاژن تبدیل شد.
نمونه‌های خشک‌شده با انجماد (حدود ۳۰۰ میلی‌گرم) در ۳ میلی‌لیتر محلول رینگر معلق و همگن شدند. همگناها در حمام آب (۷۷ درجه سانتی‌گراد، ۷۰ دقیقه) گرم شدند و سانتریفیوژ شدند (۶۰۰۰ × g، ۲۰ دقیقه). محلول رویی جدا شد و رسوب در همان محلول معلق و دوباره سانتریفیوژ شد. دو محلول رویی با هم ترکیب شدند و مقدار کلاژن محلول مطابق روش بالا تعیین شد. حلالیت حرارتی کلاژن به‌صورت درصدی از کل کلاژن بیان شد.
۲٫۱۰. پایداری حرارتی
استخراج کلاژن بافت همبند و تعیین پایداری حرارتی آن با اندکی تغییر از روش لی، ژو و ژو [25] انجام شد. دمای گذار گرماگیر کلاژن بافت همبند با کالریمتر (DSC 7؛ پرکین المر، والتهام، ماساچوست، آمریکا) اندازه‌گیری شد. کالیبراسیون دما با ترموگرام ایندیوم انجام شد. نمونه‌ها (۲۰ میلی‌گرم) دقیقاً وزن و در ظروف آلومینیومی دربسته قرار داده شدند. نمونه‌ها با سرعت ۲ درجه سانتی‌گراد بر دقیقه در بازه ۲۰ تا ۹۰ درجه سانتی‌گراد با استفاده از نیتروژن مایع به‌عنوان محیط خنک‌کننده اسکن شدند. بیشینه دمای گذار از ترموگرام و با نرم‌افزار Pyris Manager Series برآورد شد.
۲٫۱۱. تحلیل آماری
داده‌ها با مدل مختلط مطابق روش تحلیلی بیفین، اسمیت، بوش، کالینز و هاپکینز [26] و با تطبیق آن با محتوای پژوهش حاضر تحلیل شدند. عوامل ثابت، شرایط فراصوت بودند و هر تکرار شامل یک عامل تصادفی در این مدل بود. آزمایش سه بار و هر بار سه تکرار موازی انجام شد. معناداری آماری (P < 0٫05) با آزمون دانکن در نرم‌افزار IBM SPSS Statistics 22.0 تعیین شد. نمودارها با SigmaPlot 12.5 و OriginPro 8.5 رسم شدند.
۳. نتایج و بحث
۳٫۱. ریزساختار
میوفیبرها که با بافت‌های همبند پریمیزیوم و اندومیزیوم پوشیده شده‌اند، سلول‌های استوانه‌ای باریکی هستند و هر میوفیبر از پریمیزیوم، میوپلاسم، هسته سلول و تعداد زیادی میوفیبریل تشکیل شده است [27]. ریزساختار فیبرهای عضلانی با SEM قابل مشاهده است و آرایش و یکپارچگی فیبرهای عضلانی می‌تواند مستقیماً بافت نمونه را منعکس کند و از این طریق نرمی آن تعیین شود [10]. ریزساختار فیبرهای عضلانی سنگدان مرغ پس از تیمارهای مختلف فراصوت در شکل ۱ نشان داده شده است. فیبرهای عضلانی شاهد به‌صورت فشرده و منظم چیده شده بودند. هنگامی که فراصوت به‌عنوان وسیله‌ای مکمل به کار رفت، یکپارچگی ساختاری میوفیبرها آشکارا آسیب دید و میوفیبریل‌ها کاملاً نمایان شدند. در این میان، اثر تیمار فراصوت ۵۰۰ وات/۳۰ دقیقه بر یکپارچگی فیبرهای عضلانی از همه آشکارتر بود. بیشتر میوفیبریل‌ها شکسته و به‌طور چشمگیری قطعه‌قطعه شده بودند، که در لبه سلولی ضعیف و نامنظم دیده می‌شد. کاویتاسیون فراصوت سنگدان مرغ را در معرض ارتعاش سریع مولکولی قرار داد و ساختار میوفیبر شکسته و جدا شد [27]. در نتیجه، ساختار کامل بافت به‌سرعت تجزیه و قطعه‌قطعه‌شدن میوفیبریل تقویت شد (مطابق با نتایج MFI). افزون بر این، زبری نیز شاخصی پرکاربرد برای توصیف وضعیت سطح نمونه‌هاست. تضعیف فیزیکی ساختار عضله و کاویتاسیون ناشی از فراصوت بر زبری تأثیر گذاشت. زبری گوشت ممکن است به درجه انسداد (occlusion) مربوط باشد. زبری بالا به معنای درجه انسداد بالاست که برای مصرف‌کنندگان هنگام خوردن گوشت اهمیت دارد [28].
شکل ۱. اثر تیم
ارهای مختلف فراصوت بر ریزساختار (بزرگنمایی ۲۰۰۰) و نیروی برشی سنگدان مرغ. میانگین‌ها در هر شاخص با حروف کوچک متفاوت (a–c) از نظر آماری تفاوت معنادار دارند (P < 0٫05).
(نیروی برشی به نیوتن: شاهد ۷٫۵۴ ± ۰٫۰۵ᵃ؛ ۵۰۰ وات/۲۰ دقیقه ۵٫۷۶ ± ۰٫۰۴ᵇ؛ ۵۰۰ وات/۳۰ دقیقه ۵٫۵۰ ± ۰٫۱۰ᶜ؛ ۶۰۰ وات/۲۰ دقیقه ۵٫۸۴ ± ۰٫۰۴ᵇ؛ ۶۰۰ وات/۳۰ دقیقه ۵٫۸۵ ± ۰٫۰۶ᵇ)
۳٫۲. نیروی برشی
نیروی برشی وارنر–براتزلر معمولاً برای تعیین درجه شکست فیبر عضلانی به کار می‌رود که مستقیماً نرمی عضله را نشان می‌دهد، و نرمی مهم‌ترین ویژگی کیفی عضله است [20]. نیروی برشی شاهد ۷٫۵۴ نیوتن بود و نیروی برشی همه نمونه‌ها پس از تیمار فراصوت کاهش یافت. در این میان، نمونه تیمارشده با توان ۵۰۰ وات به مدت ۳۰ دقیقه کمترین نیروی برشی را داشت که نسبت به شاهد ۲۷٫۱ درصد کاهش یافته بود (شکل ۱). این نتیجه به‌روشنی نشان داد که تیمار فراصوت در بهبود نرمی سنگدان مرغ مؤثر است. این پدیده احتمالاً به آن دلیل است که اثر قوی کاویتاسیون در تیمار فراصوت می‌تواند نرم شدن بافت عضله و شکست فیبر عضلانی را تسهیل کند و به کاهش سختی نمونه بینجامد [29]. شیونگ و همکاران [30] دریافتند که نیروی برشی سینه مرغ عمل‌آوری‌شده با نمک‌سود کمکی سدیم بی‌کربنات به‌همراه فراصوت (USC) (فرکانس: ۲۰ کیلوهرتز، حالت متناوب: ۵ ثانیه/۵ ثانیه، توان: ۳۰۰ وات، زمان: ۵۰ دقیقه) به‌طور معناداری کمتر از نمونه عمل‌آوری‌شده با سدیم بی‌کربنات (SC) بود. دلیل پایین‌تر بودن نیروی برشی مرغ USC نسبت به مرغ SC آن است که فراصوت می‌تواند لیزوزوم‌ها را تخریب کند و کاتپسین آزاد کند، که ساختار فیبر عضلانی را تضعیف می‌کند و در نهایت به کاهش نیروی برشی می‌انجامد. در کنار این پژوهش، کاویتاسیون صوتی امواج فراصوت می‌تواند ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی را تغییر دهد و فرآوری و عمل‌آوری را از طریق انقباض و انبساط در بافت گوشت ممکن سازد. افزون بر این، دلیل بالاتر بودن فرکانس و توان فراصوت در این پژوهش آن است که سنگدان مرغ سخت‌تر از گوشت سینه مرغ است. بنابراین هنگام استفاده از فراصوت برای بهبود نرمی گوشت و فرآورده‌های گوشتی باید شرایط مناسب انتخاب شود.
۳٫۳. شاخص قطعه‌قطعه‌شدن میوفیبریل
MFI شاخصی برای سنجش میانگین طول میوفیبریل‌هاست و با درجه تخریب ساختار درونی فیبرهای عضلانی و پروتئین‌های اسکلتی همبستگی مثبت دارد [31]. MFI شاهد ۱۲٫۶ بود و MFI همه نمونه‌ها پس از تیمار فراصوت افزایش یافت. دلیل آن است که فراصوت می‌تواند ساختار شبکه‌ای پروتئین را بشکند و استحکام ساختار شبکه‌ای پروتئین کاهش یابد؛ به‌ویژه رشته‌های ضخیم موجود در غشاهایی که دسته‌های فیبر عضلانی را می‌سازند راحت‌تر حل می‌شوند، که به افزایش مقادیر MFI منجر شد [30].
شایان توجه است که MFI نمونه‌های تیمارشده با فراصوت ۵۰۰ وات (۲۰ و ۳۰ دقیقه) بالاتر از نمونه‌های تیمارشده با فراصوت ۶۰۰ وات (۲۰ و ۳۰ دقیقه) بود و MFI نمونه ۵۰۰ وات/۳۰ دقیقه از همه بیشتر بود. کاریو-لوپز، هوئرتا-خیمنز، گارسیا-گالیسیا و آلارکون-روخو [32] نیز نشان دادند که تیمار بیش‌ازحد فراصوت اثر مثبتی بر بهبود نرمی ماهیچه longissimus dorsi خوک ندارد. دلیل این پدیده آن است که تیمار متوسط فراصوت فضای بین فیبرهای عضلانی را افزایش می‌دهد، به‌طوری که محتویات آزادشده از سلول‌ها می‌توانند فیبرهای عضلانی را کامل‌تر به قطعاتی با اندازه‌های مختلف تجزیه کنند، که به افزایش MFI و بهبود نرمی عضله می‌انجامد [33].
۳٫۴. قطر فیبر عضلانی
قطر فیبر عضلانی یکی از عوامل مهم مؤثر بر نرمی عضله است و هرچه قطر فیبر عضلانی کوچک‌تر باشد، عضله نرم‌تر است [34]. همان‌طور که در شکل ۲ نشان داده شده است، قطر فیبر عضلانی شاهد ۴۳٫۵ میکرومتر بود و قطر فیبر عضلانی همه نمونه‌ها پس از تیمار فراصوت به‌طور معناداری کاهش یافت (P < 0٫05). ارتعاش ناشی از خود موج فراصوت می‌تواند با تخریب برهمکنش‌های مولکولی (مانند پیوندهای هیدروژنی و نیروهای واندروالس) به بافت عضله آسیب فیزیکی وارد کند. بنابراین ممکن است یکپارچگی خط Z از طریق فراصوت آسیب ببیند و به شکست فیبرهای عضلانی بینجامد. افزون بر این، میکروجت و تنش برشی بالای ناشی از اثر کاویتاسیون فراصوت باعث ناپدید شدن خط M، شکست باند I و تورم ناحیه H می‌شود و به کاهش قطر فیبر عضلانی می‌انجامد [35]. این نتیجه را ریزساختار عضله (شکل ۱) نیز به‌خوبی توضیح می‌دهد.
هنگامی که توان فراصوت ۵۰۰ وات بود، قطر فیبر عضلانی نمونه تیمارشده به مدت ۳۰ دقیقه ۷٫۰۰ درصد کوچک‌تر از نمونه تیمارشده به مدت ۲۰ دقیقه بود. وقتی توان فراصوت به ۶۰۰ وات افزایش یافت، قطر فیبر عضلانی نمونه با طولانی‌تر شدن زمان فراصوت (از ۲۰ به ۳۰ دقیقه) افزایش یافت. به‌ویژه قطر فیبر عضلانی نمونه تیمارشده با ۵۰۰ وات/۳۰ دقیقه کوچک‌ترین بود و ۳۲٫۱ میکرومتر بود. تیمار متوسط فراصوت می‌تواند ساختار میوفیبریل‌ها را تخریب کند، موجب آزاد شدن کالپاین از سلول‌ها شود، پیوندهای عرضی بین پروتئین‌ها را تضعیف کند و قطر فیبرهای عضلانی را کاهش دهد. تیمار بیش‌ازحد فراصوت ممکن است تا حدی به پروتئاز آسیب بزند و نتواند بهترین اثر شکافتن فیبرهای عضلانی را ایجاد کند [36].
شکل ۲. اثر تیمارهای مختلف فراصوت بر شاخص قطعه‌قطعه‌شدن میوفیبریل و قطر فیبر عضلانی سنگدان مرغ. میانگین‌ها در هر شاخص با حروف کوچک متفاوت (a–d) از نظر آماری تفاوت معنادار دارند (P < 0٫05).
۳٫۵. ضخامت پریمیزیوم
بافت همبند سه ساختار اصلی دارد: اپی‌میزیوم (که بیرون توده کامل عضله را می‌پوشاند)، پریمیزیوم (که بیرون دسته عضلانی را می‌پوشاند) و اندومیزیوم (که میان فیبرهای عضلانی وجود دارد). در جریان قطعه‌بندی و پیرایش عضله، اپی‌میزیوم اغلب برداشته می‌شود و بافت همبند درون‌عضلانی باقی‌مانده عمدتاً به اندومیزیوم و پریمیزیوم اشاره دارد. افزون بر این، پریمیزیوم ۹۰ درصد کل بافت همبند درون‌عضلانی را تشکیل می‌دهد و به پریمیزیوم اولیه و پریمیزیوم ثانویه تقسیم می‌شود [37].
اثر تیمارهای مختلف فراصوت بر ضخامت پریمیزیوم سنگدان مرغ در شکل ۳ نشان داده شده است. در مقایسه با شاهد، ضخامت پریمیزیوم اولیه و ثانویه سنگدان مرغ پس از تیمار فراصوت کاهش یافت. شایان ذکر است که ضخامت پریمیزیوم اولیه و ثانویه نمونه‌های تیمارشده با فراصوت ۵۰۰ وات/۳۰ دقیقه به کمترین مقادیر خود (۲۳٫۴۹ و ۱۰۴٫۵۴ میکرومتر) رسید که نسبت به شاهد ۲۲٫۸ و ۱۹٫۷ درصد کاهش یافته بود. جریان‌های ریز و تلاطم ناشی از فراصوت، تجزیه پروتئین‌ها و پلی‌ساکاریدهای پریمیزیوم را در حد بیشتری تقویت می‌کند و ساختار بافت همبند درون‌عضلانی را تضعیف می‌کند [38]. میکروجت تولیدشده توسط فراصوت همچنین می‌تواند پارگی سلول‌های عضلانی و انقباض سارکومر را تسریع کند و به جدا شدن تدریجی فیبرهای عضلانی بینجامد، که به‌صورت کاهش ضخامت پریمیزیوم ظاهر می‌شود [39].
۳٫۶. استحکام مکانیکی
استحکام مکانیکی بافت همبند نه‌تنها به اندازه و آرایش فیبرهای کلاژن، بلکه به پیوند عرضی مولکول‌های پروتئین کلاژن نیز بستگی دارد. افزون بر این، تغییر استحکام مکانیکی بافت همبند می‌تواند مستقیماً بر نرمی عضله اثر بگذارد [40]. استحکام مکانیکی نمونه‌های تیمارشده با فراصوت کمتر از شاهد بود و استحکام مکانیکی نمونه تیمارشده با فراصوت ۳۰ دقیقه در توان ۵۰۰ وات کمترین بود (۲٫۶۴ نیوتن) که ۶۳٫۶ درصد کمتر از شاهد بود. اثر کاویتاسیون ایجادشده توسط فراصوت می‌تواند یکپارچگی پریمیزیوم و اندومیزیوم را تخریب کند و به گسیختگی اتصال بین فیبرهای کلاژن و تضعیف ساختار بافت همبند درون‌عضلانی بینجامد؛ و برای توضیح این پدیده در سطحی عمیق‌تر، پیوند عرضی بین مولکول‌های پروتئین کلاژن که برای تثبیت استحکام مکانیکی به کار می‌رود تا حدی شکسته می‌شود [41].
با این حال، هنگامی که توان فراصوت ۶۰۰ وات بود (چه زمان فراصوت ۲۰ دقیقه و چه ۳۰ دقیقه)، استحکام مکانیکی نمونه‌ها بیشتر از نمونه تیمارشده با ۵۰۰ وات به مدت ۳۰ دقیقه بود. این نتیجه با روند تغییر نیروی برشی (شکل ۱) همخوانی خوبی داشت و اثر بهبوددهنده تیمار متوسط فراصوت (۵۰۰ وات/۳۰ دقیقه) بر نرمی عضله را بیشتر تأیید کرد. چانگ و همکاران [12] در بررسی اثرات تیمار فراصوت بر بافت همبند گوشت گاو نتایج مشابهی به دست آوردند. استحکام مکانیکی نمونه گوشت گاو تحت فراصوت ۵۰ دقیقه‌ای تفاوت معناداری (P < 0٫01) با نمونه شاهد داشت. این نتیجه تأیید کرد که تضعیف بافت همبند توسط فراصوت پرتوان عامل اصلی نرم شدن گوشت است.
شکل ۳. اثر تیمارهای مختلف فراصوت بر ضخامت پریمیزیوم و استحکام مکانیکی بافت همبند سنگدان مرغ. میانگین‌ها در هر شاخص با حروف کوچک متفاوت (a–d) از نظر آماری تفاوت معنادار دارند (P < 0٫05).
۳٫۷. پیوند عرضی کووالانسی کلاژن
نرمی عضله ارتباط نزدیکی با ساختار فضایی و نیروی برهمکنش کلاژن دارد [42]. تغییر نرمی عضله عمدتاً ناشی از تبدیل کلاژن از پیوند عرضی بین‌مولکولی مبتنی بر دی‌سولفید به پیوند عرضی درون‌مولکولی مبتنی بر لیزین و هیدروکسی‌لیزین (پیوند عرضی پیریدینی) در جریان رسیدن (maturation) است. محتوای پیریدینولین هیدروکسی‌لیزین و پیریدینولین لیزین شاخص‌های مستقیم بیانگر درجه پیوند عرضی پیریدینولین هستند [43].
همان‌طور که در شکل ۴ نشان داده شده است، محتوای پیریدینولین هیدروکسی‌لیزین و پیریدینولین لیزین نمونه‌های تیمارشده با فراصوت ۵۰۰ وات به مدت ۳۰ دقیقه کمترین مقدار را داشت (۱۰٫۷۶ و ۱۱٫۵۹ نانوگرم بر گرم) و به‌ترتیب ۲۳٫۱ و ۴۰٫۵ درصد کمتر از شاهد بود، اما بین سایر گروه‌های تیمار تفاوت معناداری وجود نداشت (P > 0٫05). ساختار بافت‌شناختی نیز به‌طور غیرمستقیم نشان می‌داد که درجه پیوند عرضی کلاژن در این شرایط فراصوت احتمالاً تا حداکثر ممکن تخریب شده است، که به تضعیف ساختار شبکه‌ای بافت همبند انجامید (شکل ۴). این پدیده نشان داد که تیمار فراصوت با شدت مناسب می‌تواند ساختار فضایی کلاژن را تخریب کند، محتوای پیریدینولین هیدروکسی‌لیزین و پیریدینولین لیزین کلاژن را کاهش دهد (درجه پیوند عرضی درون‌مولکولی کلاژن را بکاهد) و در نهایت نرمی عضله را بهبود دهد.
شکل ۴. اثر تیمارهای مختلف فراصوت بر ساختار بافت‌شناختی (۴ برابر)، محتوای پیریدینولین هیدروکسی‌لیزین و پیریدینولین لیزین سنگدان مرغ. میانگین‌ها در هر شاخص با حروف کوچک متفاوت (a, b) از نظر آماری تفاوت معنادار دارند (P < 0٫05).
۳٫۸. محتوای کلاژن
محتوای کلاژن و حلالیت حرارتی، افزون بر پیوند عرضی کووالانسی، عوامل مهم مؤثر بر نرمی عضله‌اند [44]. به‌طور کلی، حلالیت کلاژن بر پایه تضعیف پیوند عرضی با نرمی همبستگی مثبت دارد [45]. اثر تیمارهای مختلف فراصوت بر محتوای کلاژن محلول و نامحلول و حلالیت حرارتی کلاژن در جدول ۱ نشان داده شده است.
محتوای کلاژن محلول، نامحلول و کل در شاهد به‌ترتیب ۰٫۶۸، ۴٫۳۸ و ۵٫۰۶ درصد بود. پس از تیمار فراصوت، محتوای کلاژن محلول افزایش یافت، در حالی که محتوای کلاژن نامحلول و کل کاهش یافت. مقدار این سه ماده با نرمی و ویژگی‌های حسی (طعم و آبداری) همبستگی خوبی داشت. کلاژن کل، کلاژن نامحلول و کلاژن محلول با نرمی همبستگی منفی داشتند. کلاژن نامحلول با آبداری همبستگی مثبت و کلاژن محلول با آبداری همبستگی منفی داشت. کلاژن نامحلول و کلاژن محلول با طعم همبستگی منفی داشتند [46]. در مقایسه با شاهد، محتوای کلاژن محلول نمونه تیمارشده با فراصوت ۵۰۰ وات/۳۰ دقیقه ۱۷۰٫۶ درصد افزایش یافت و محتوای کلاژن نامحلول و کلاژن کل به‌ترتیب ۳۷٫۰ و ۹٫۰۹ درصد کاهش یافت. نتایج نشان داد که تیمار مناسب فراصوت می‌تواند نرمی، طعم و آبداری سنگدان مرغ را بهبود دهد. این پدیده ممکن است ناشی از اثر کاویتاسیون فراصوت باشد که ساختار کامل میتوکندری و لیزوزوم را تخریب می‌کند و برخی پروتئازهای درون‌زاد را آزاد می‌سازد و به افزایش محتوای کلاژن محلول و کاهش محتوای کلاژن نامحلول می‌انجامد. با این حال، از نظر محتوای کل کلاژن، زو و همکاران [47] در پژوهش خود درباره استخراج کلاژن از کالیپاش لاک‌پشت نرم‌پوست با کمک فراصوت نتایج متضادی به دست آوردند، که ممکن است به دلیل توان و فرکانس متفاوت فراصوت باشد.
جدول ۱. اثر تیمارهای مختلف فراصوت بر محتوای کلاژن محلول، کلاژن نامحلول، کلاژن کل، حلالیت حرارتی و پایداری حرارتی کلاژن.
| شاخص | شاهد | ۵۰۰ وات / ۲۰ دقیقه | ۵۰۰ وات / ۳۰ دقیقه | ۶۰۰ وات / ۲۰ دقیقه | ۶۰۰ وات / ۳۰ دقیقه |
|---|---|---|---|---|---|
| کلاژن محلول (%) | 0.68 ± 0.63ᶜ | 1.40 ± 0.96ᵇ | 1.84 ± 0.36ᵃ | 1.48 ± 0.96ᵇ | 1.52 ± 0.96ᵇ |
| کلاژن نامحلول (%) | 4.38 ± 0.96ᵃ | 3.48 ± 0.16ᵇ | 2.76 ± 0.63ᶜ | 3.35 ± 0.36ᵇ | 3.45 ± 0.63ᵇ |
| کلاژن کل (%) | 5.06 ± 0.73ᵃ | 4.87 ± 0.73ᵇᶜ | 4.60 ± 0.36ᵈ | 4.83 ± 0.11ᶜ | 4.97 ± 0.36ᵃᵇ |
| حلالیت حرارتی (%) | 13.5 ± 1.3ᶜ | 28.7 ± 2.3ᵇ | 39.9 ± 1.0ᵃ | 30.6 ± 1.4ᵇ | 30.5 ± 1.7ᵇ |
| T_max (°C) | 47.5 ± 0.3ᵃ | 45.2 ± 0.2ᵇ | 43.3 ± 0.4ᶜ | 47.2 ± 0.3ᵃ | 47.0 ± 0.2ᵃ |
| ΔH (J/g) | 0.701 ± 0.025ᵃ | 0.615 ± 0.008ᵇ | 0.549 ± 0.005ᶜ | 0.690 ± 0.013ᵃ | 0.674 ± 0.010ᵃ |
مقادیر جدول میانگین ± انحراف معیار حداقل سه تکرار هستند. میانگین‌ها در هر ردیف با حروف کوچک متفاوت (a–d) از نظر آماری تفاوت معنادار دارند (P < 0٫05).
حلالیت حرارتی شاهد ۱۳٫۵ درصد بود و حلالیت حرارتی همه نمونه‌ها پس از تیمار فراصوت بهبود یافت. شایان ذکر است که حلالیت حرارتی کلاژن در شرایط فراصوت ۵۰۰ وات/۳۰ دقیقه بیشترین مقدار را داشت (۳۹٫۹ درصد). مطالعات نشان داده‌اند که بین حلالیت حرارتی کلاژن و نیروی برشی عضله همبستگی منفی وجود دارد [24]. در این پژوهش، نمونه‌های تیمارشده با فراصوت ۵۰۰ وات/۳۰ دقیقه کمترین نیروی برشی و بیشترین حلالیت حرارتی را داشتند، که با هم نشان می‌دهد عضله در این شرایط بهترین نرمی را دارد.
۳٫۹. پایداری حرارتی کلاژن
پایداری حرارتی کلاژن سنگدان مرغ با دمای گذار (Tmax) و آنتالپی (ΔH) در DSC نشان داده می‌شود. Tmax بیانگر دمای واسرشت‌شدن حرارتی کلاژن است و ΔH بیانگر مقدار انرژی لازم برای واسرشت‌شدن حرارتی کلاژن [7]. Tmax و ΔH کلاژن تیمارشده با تیمارهای مختلف فراصوت در جدول ۱ نشان داده شده است. دیده می‌شود که برای همه نمونه‌ها تنها یک Tmax وجود داشت که حدود ۴۷٫۰ درجه سانتی‌گراد بود. Tmax شاهد ۴۸٫۵ درجه سانتی‌گراد بود و Tmax همه نمونه‌های فراصوت کمتر از شاهد بود، که نشان می‌دهد پایداری حرارتی نمونه‌ها پس از تیمار فراصوت کاهش یافت. نکته قابل‌توجه این است که نمونه ۵۰۰ وات/۳۰ دقیقه کمترین Tmax را داشت (۴۳٫۳ درجه سانتی‌گراد). چانگ و همکاران [12] ماهیچه semitendinosus گاو را با توان ۱۵۰۰ وات (۴۰ کیلوهرتز) به مدت ۳۰ دقیقه تیمار کردند و Tmax کلاژن کمترین مقدار را داشت. با این حال، Tmax کلاژن با ادامه تیمار فراصوت روند افزایشی نشان داد، که با نتایج این پژوهش مشابه بود.
ΔH روندی مشابه Tmax نشان داد و نمونه تیمارشده با فراصوت ۵۰۰ وات/۳۰ دقیقه کمترین ΔH دلیل آن است که تیمار مناسب فراصوت اثر کاویتاسیون قوی ایجاد می‌کند که پیوند هیدروژنی نگه‌دارنده ساختار مارپیچ سه‌گانه کلاژن را تخریب و پایداری حرارتی آن را کاهش می‌دهد [48]. با این حال، چنانکه از نتایج پیریدینولین هیدروکسی‌لیزین و پیریدینولین لیزین (شکل ۴) پیداست، تیمار بیش‌ازحد فراصوت ممکن است نقش مشابهی در تخریب ساختار کلاژن و پیوند عرضی کووالانسی ایفا نکند
