مداخله موسیقی، اختلال سد روده‌ای و استرس ایمنی ناشی از LPS را در مرغان گوشتی از طریق تنظیم مسیر TLR4/NF-κB کاهش می‌دهد

فایل PDF مقاله را اینجا دانلود کنید.

مقدمه

موسیقی زبانی جهانی است و موسیقی‌درمانی کاربردپذیری گسترده‌ای با مزایایی مانند هزینه پایین، نبود عوارض جانبی و سهولت استفاده دارد. اگرچه هنوز موضوع بحث است، بسیاری از مطالعات نشان می‌دهند که موسیقی ممکن است به کاهش پاسخ‌های استرسی کمک کند (Ciborowska et al., 2021; Marchetto et al., 2021; Snowdon, 2021). در انسان، موسیقی معمولاً برای بهبود بهزیستی، کاهش استرس و منحرف کردن توجه از علائم ناخوشایند به کار می‌رود (Linnemann et al., 2015; Ginsberg et al., 2022). در سال‌های اخیر، پژوهشگران اثرات موسیقی را بر فیزیولوژی و رفتار گونه‌های مختلف جانوری بررسی کرده‌اند و دریافته‌اند که موسیقی می‌تواند با پوشاندن صداهای زمینه بالقوه و فراهم کردن غنی‌سازی شنیداری، اضطراب، استرس و رفتارهای پرخاشگرانه را کاهش دهد و بدین‌وسیله سلامت و رفاه حیوان را بهبود بخشد (Amaya et al., 2020; Lindig et al., 2020). به‌طور مشابه، غنی‌سازی با موسیقی اغلب در سامانه‌های پرورش آبزیان با گردش آب برای ماهی و در فرایند تولید شیر در سامانه‌های خودکار گاو شیری به کار می‌رود (Guh et al., 2021; Zhao et al., 2023). افزون بر این، نشان داده شده که مداخلات موسیقایی عملکرد ایمنی را تقویت می‌کنند و بر پاسخ‌های عصبی-غدد درون‌ریز اثر می‌گذارند (Pant et al., 2022). پژوهش‌های پیشین آزمایشگاه ما نشان داده است که مواجهه طولانی‌مدت با موسیقی کلاسیک می‌تواند بیان هیجانات مثبت را در بچه‌خوک‌ها افزایش دهد و سطح ایمونوگلوبولین G (IgG)، اینترلوکین-۴ (IL-4) و اینترفرون گاما (IFN-γ) را بالا ببرد و بدین ترتیب وضعیت ایمنی آن‌ها را بهبود بخشد (Nian et al., 2023). افزون بر این، یافته‌های اخیر ما نشان می‌دهد که مواجهه بلندمدت با موسیقی به‌طور مؤثر التهاب اندام‌های ایمنی ناشی از استرس حاد نویز را کاهش می‌دهد (Wang et al., 2024). با این حال، اینکه آیا موسیقی می‌تواند استرس ایمنی ناشی از LPS را تعدیل کند، هنوز گزارش نشده است.

اختلال سد مخاطی ناشی از بیماری‌های روده‌ای یکی از محدودیت‌های عمده صنعت طیور است و افزایش نفوذپذیری حاصل از آن نه‌تنها به کاهش کارایی جذب مواد مغذی می‌انجامد، بلکه از طریق مسیرهای عفونت منشأ‌گرفته از روده، سلامت سیستمیک را نیز تهدید می‌کند (Wickramasuriya et al., 2022). LPS به‌عنوان عامل ویرولانس اصلی باکتری‌های گرم‌منفی، نقش کلیدی در بروز بیماری‌های روده‌ای دارد و با فعال‌سازی محور سیگنالینگ TLR4/NF-κB آبشار التهابی را راه می‌اندازد، که سازوکار اصلی آسیب ایمنی در بخش‌های حساس روده مانند ژژنوم و ایلئوم است (Yang et al., 2021; Cardoso et al., 2023). اگرچه جایگاه محوری سامانه ایمنی مخاطی روده مرغ در شبکه دفاع ایمنی حیوان به‌طور گسترده شناخته شده است، پژوهش درباره اثرات کاهنده و سازوکارهای مداخله موسیقی بر آسیب استرسی روده هنوز اندک است. با توجه به ارتباط نزدیک میان آسیب عملکرد سد ناشی از استرس روده‌ای و کاهش عملکرد طیور، بررسی سازوکارهای تنظیمی مداخله موسیقی بر التهاب روده ارزش علمی بالایی دارد. در پژوهش حاضر، موسیقی موتزارت K448 با الگوهای فرکانسی مشخص انتخاب شد و با ساخت مدل استرس ایمنی ناشی از LPS، اثرات تنظیمی این مداخله موسیقایی بر یکپارچگی سد روده‌ای مرغ، نمایه بیان فاکتورهای التهابی و مسیر سیگنالینگ TLR4/NF-κB به‌طور نظام‌مند بررسی شد. این پژوهش نه‌تنها مبنای تجربی برای توسعه برنامه‌های سازگار با محیط‌زیست جهت تنظیم سلامت روده فراهم می‌کند، بلکه پتانسیل کاربرد میان‌رشته‌ای مداخله موسیقی را در ارتقای رفاه حیوانات در شرایط پرورش متراکم آشکار می‌سازد و راه‌های نوآورانه‌ای برای کاهش استرس می‌گشاید.

مواد و روش‌ها

روش‌های آزمایشی این پژوهش توسط کمیته نهادی مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه کشاورزی شمال‌شرق در استان هیلونگجیانگ چین تأیید شد (شماره تأییدیه NEAUEC20210234) (Chang et al., 2024).

گروه‌بندی و نگهداری حیوانات آزمایشی

در مجموع ۱۹۲ قطعه جوجه گوشتی نر AA با وزن‌های مشابه (۳۶ ± ۰٫۵ گرم) به‌طور تصادفی به چهار گروه، هر یک با ۶ تکرار و هر تکرار ۸ جوجه، برای یک دوره پرورش ۲۸ روزه اختصاص یافتند. آزمایش در چهار اتاق مجاور با محیط کنترل‌شده و شرایط پرورش یکسان انجام شد. در طول آزمایش، آب آشامیدنی جوجه‌ها از طریق سامانه آب جاری تأمین شد تا تازگی و پاکیزگی آب تضمین شود و هم‌زمان تعداد دفعات نوشیدن و مصرف آب جوجه‌ها افزایش یابد. جیره‌ها طبق فرمول علمی دقیقی تنظیم شد که ترکیب و نسبت اجزای آن در STable 1 ضمیمه آمده است. دمای اتاق در روزهای ۱ تا ۳ روی ۳۵ درجه سانتی‌گراد، در روزهای ۴ تا ۷ روی ۳۲ تا ۳۳ درجه تنظیم شد و سپس هر سه روز ۲ تا ۳ درجه کاهش یافت تا به ۲۰ درجه رسید و تا پایان آزمایش در همین مقدار نگه داشته شد (STable 2). رطوبت نسبی روی ۵۰ درصد ثابت بود. هر اتاق دو چراغ داشت تا نور به‌طور یکنواخت در کل قفس جوجه‌ها پخش شود و هر اتاق به دیمر و تایمر متصل بود. بین اتاق‌ها تداخل صوتی وجود نداشت و سطح نویز در اتاق‌های کنترل‌شده زیر ۴۵ دسی‌بل (TASI، جیانگسو، چین) نگه داشته شد.

گروه MUS و گروه MUS+LPS از روز اول روزانه ۶ ساعت (از ساعت ۱۰:۰۰ تا ۱۶:۰۰) در معرض موسیقی (موتزارت K.448) قرار گرفتند و سطح صدا بین ۶۵ تا ۷۵ دسی‌بل کنترل شد و این روند تا پایان آزمایش در روز ۲۸ ادامه یافت. موقعیت پخش‌کننده‌های موسیقی و جوجه‌ها در سراسر آزمایش ثابت ماند. در روزهای ۱۴، ۱۶ و ۱۸، گروه استرس ایمنی LPS و گروه MUS+LPS برای ایجاد مدل استرس ایمنی، ۵۰۰ میکروگرم بر کیلوگرم LPS حل‌شده در سالین را به‌صورت درون‌صفاقی دریافت کردند (Rajput et al., 2013)، در حالی که گروه شاهد و گروه تحریک موسیقایی حجم برابری سالین گرفتند. تیمارهای آزمایشی اختصاصی در شکل ۱ نشان داده شده است. در طول آزمایش، موقعیت پخش‌کننده‌های صوتی و جوجه‌ها بدون تغییر ماند. محلول LPS با رقیق کردن بلورهای LPS (سولاربیو، پکن) (Escherichia coli سروتیپ O55:B5) در سالین تهیه شد و دوز و راه تجویز بر اساس مطالعه قبلی راجپوت و همکاران بود.

[محل شکل ۱] شکل ۱. فرایند آزمایش روی جوجه‌های گوشتی و فلوچارت زمان‌های نمونه‌برداری.

اندازه‌گیری عملکرد رشد

در روزهای ۰، ۱۴ و ۲۸ آزمایش، جوجه‌های هر تکرار پس از ۱۲ ساعت ناشتایی وزن‌کشی شدند و مصرف خوراک هر تکرار در روزهای ۱۴ و ۲۸ ثبت شد تا میانگین افزایش وزن روزانه (ADG)، میانگین مصرف خوراک روزانه (ADFI) و ضریب تبدیل خوراک (F/G) برای هر دوره محاسبه شود. تلفات روزانه ثبت شد و شاخص‌های عملکرد متعاقباً بر اساس تلفات تعدیل شدند.

تحلیل فراساختاری روده

میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM): قطعاتی از ژژنوم و ایلئوم که با سالین فیزیولوژیک شسته شده بودند، برای مشاهده آماده شدند. نمونه‌های بافتی با ضخامت ۲ تا ۳ میلی‌متر، طول ۳ تا ۴ میلی‌متر و عرض ۲ میلی‌متر بریده شدند و جهت‌گیری آن‌ها به این صورت تعیین شد که سطح پرزی در بالا (سمت مثبت) و سطح سروزی در پایین (سمت منفی) قرار گیرد. هر گروه دست‌کم سه تکرار داشت و در هر تکرار ۵ تا ۶ نمونه بافتی بود. نمونه‌ها به مدت ۲ تا ۴ ساعت در گلوتارآلدهید ۲٫۵ درصد تثبیت شدند، سپس سه بار و هر بار ۱۵ دقیقه با بافر فسفات نمکی ۰٫۱ مولار (PBS، pH 7٫4) شسته شدند. سپس در اسمیوم تتروکسید ۱ درصد در دمای اتاق و در تاریکی به مدت ۱ تا ۲ ساعت تثبیت شدند و پس از آن دوباره سه بار و هر بار ۱۵ دقیقه با PBS ۰٫۱ مولار (pH 7٫4) شسته شدند. بافت‌ها با شیب غلظتی اتانول ۳۰، ۵۰، ۷۰، ۸۵، ۹۵ و ۱۰۰ درصد (دو بار) آب‌گیری شدند و هر مرحله ۱۵ دقیقه طول کشید. سپس نمونه‌ها به مدت ۱۰ دقیقه در مخلوط ۱:۱ ایزوآمیل استات و اتانول و بعد به مدت ۱۰ دقیقه دیگر در ایزوآمیل استات خالص غوطه‌ور شدند. نمونه‌ها به سبد نمونه منتقل و در خشک‌کن نقطه بحرانی پیش‌سردشده قرار گرفتند و دی‌اکسید کربن مایع وارد شد. دما به ۱۵ درجه سانتی‌گراد رسانده شد و ۱۰ دقیقه نگه داشته شد، سپس برای گازی شدن CO₂ به ۳۵ درجه افزایش یافت. پس از تخلیه، نمونه‌ها بیرون آورده شدند و با چسب رسانا روی پایه‌های نمونه نصب شدند. نمونه‌ها با دستگاه پوشش‌دهی یونی پوشش داده شدند و در دسیکاتور در دمای اتاق نگهداری شدند. تصاویر با میکروسکوپ الکترونی روبشی گرفته شد. ابزار و معرف‌های مورد استفاده در روش SEM در STable 3 و 4 آمده است.

میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM): بافت‌های تازه ژژنوم و ایلئوم جمع‌آوری و به قطعات کوچک حدود ۱ میلی‌متر مکعب بریده شدند. نمونه‌های بافتی به مدت ۲ تا ۴ ساعت در گلوتارآلدهید ۲٫۵ درصد در ۴ درجه سانتی‌گراد تثبیت شدند. سپس نمونه‌ها به مدت ۱ ساعت در اسمیوم تتروکسید ۱ درصد در ۴ درجه قرار گرفتند. پس از تثبیت، نمونه‌ها با سری اتانول ۳۰، ۵۰، ۷۰، ۸۵، ۹۵ و ۱۰۰ درصد (دو بار) آب‌گیری شدند و هر مرحله ۱۵ دقیقه طول کشید. سپس نمونه‌ها یک شب در مخلوطی از استون و محیط قالب‌گیری به نسبت مساوی نفوذ داده شدند. نمونه‌ها در قالب‌های قالب‌گیری جاسازی شدند و برای پلیمریزاسیون کامل رزین به مدت ۴۸ ساعت در آون ۶۰ درجه قرار گرفتند. برش‌های فوق‌نازک ۷۰ نانومتری از نواحی مورد نظر تهیه و روی توری‌های مسی جمع‌آوری شد. برش‌ها به مدت ۸ دقیقه با اورانیل استات ۳ درصد در اتانول اشباع رنگ‌آمیزی شدند، سپس سه بار با اتانول ۷۰ درصد و سه بار با آب فوق‌خالص شسته شدند. سپس به مدت ۸ دقیقه با محلول سیترات سرب ۲٫۷ درصد رنگ‌آمیزی شدند و بعد سه بار با آب فوق‌خالص شسته و با کاغذ صافی کمی خشک شدند. مشاهدات و تصویربرداری با میکروسکوپ الکترونی عبوری انجام شد. تجهیزات و معرف‌های روش TEM بر اساس مطالعه قبلی (Wang et al., 2024) بود.

سنجش فعالیت آنتی‌اکسیدانی

برای ارزیابی بیشتر فعالیت آنتی‌اکسیدانی ژژنوم و ایلئوم، نمونه‌ها در لوله‌های آسیاب قرار داده شدند و بافت‌های روده همگن و سانتریفیوژ شدند. کیت‌های سنجش از Nanjing Jiancheng تهیه شد و روش‌های آزمایشی دقیقاً طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. حدود ۰٫۳ گرم بافت مخاطی ژژنوم و ایلئوم روی یخ جمع‌آوری و با ۹ میلی‌لیتر محلول سدیم کلرید ۰٫۹ درصد همگن شد و سپس برای به‌دست آوردن محلول رویی در ۴ درجه (۳۰۰۰ دور در دقیقه، ۱۵ دقیقه) سانتریفیوژ شد. غلظت پروتئین با روش BCA تعیین شد. فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (SOD) و گلوتاتیون پراکسیداز (GSH-PX) و نیز مقدار مالون‌دی‌آلدهید (MDA) در محلول رویی همگنای مخاطی ژژنوم و ایلئوم با کیت‌های تجاری (Nanjing Jiancheng، نانجینگ، چین) اندازه‌گیری شد. همه مراحل طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. داده‌های بیوشیمیایی بر اساس محتوای پروتئین همگناها نرمالیزه شدند.

آزمون الایزا (ELISA)

سطح سرمی کورتیکواستروئیدها (CORT)، هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH)، دی‌آمین اکسیداز (DAO) و D-لاکتیک اسید (D-LA)، و نیز غلظت اینترلوکین-۱β (IL-1β)، اینترلوکین-۶ (IL-6) و اینترلوکین-۱۰ (IL-10) در بافت مخاطی ژژنوم و ایلئوم، با کیت‌های تجاری ELISA (Huijia Biotechnology، شیامن، فوجیان، چین) اندازه‌گیری شد. همه مراحل طبق دستورالعمل سازنده انجام شد.

بیان ژن با PCR کمی زمان واقعی

۰٫۱ گرم از بافت مخاطی ژژنوم و ایلئوم با ترازوی تحلیلی وزن و در لوله آسیاب ۱٫۵ میلی‌لیتری فاقد RNase قرار داده شد. سپس ۱ میلی‌لیتر معرف RNAiso PLUS (TaKaRa، دالیان، چین) و دو مهره آسیاب اضافه شد. لوله به‌آرامی تکان داده شد تا نمونه کاملاً غوطه‌ور شود و سپس بافت با آسیاب برودتی پیش‌سردشده کاملاً خرد شد. بعد ۲۰۰ میکرولیتر کلروفرم به لوله اضافه شد و با دست تکان داده شد تا محتویات مخلوط شود و ۵ دقیقه در ۴ درجه انکوبه شد. مخلوط به مدت ۱۵ دقیقه در ۱۲٬۰۰۰ دور در دقیقه و ۴ درجه سانتریفیوژ شد. سپس ۴۰۰ میکرولیتر از محلول رویی به لوله ۱٫۵ میلی‌لیتری EP جدید فاقد RNase منتقل و با ۴۰۰ میکرولیتر ایزوپروپانول ترکیب شد و ۱۰ دقیقه در ۴ درجه انکوبه شد. مخلوط ۱۰ دقیقه در ۱۳٬۰۰۰ دور در دقیقه و ۴ درجه سانتریفیوژ شد. محلول رویی دور ریخته شد و رسوب سه بار با اتانول ۷۵ درصد شسته شد (Wang et al., 2024). نمونه ۵ دقیقه در ۱۲٬۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و رسوب سفیدی در ته لوله ایجاد شد. محلول رویی دور ریخته شد و رسوب در ۵۰ میکرولیتر آب تیمارشده با DEPC حل شد. غلظت و خلوص RNA با اسپکتروفتومتر UV (Eppendorf، آلمان) با اندازه‌گیری نسبت OD 260/280 (بین ۱٫۸ و ۲٫۲) تعیین شد. سپس RNA برای رونویسی معکوس بعدی به غلظت یکسان رسانده شد. cDNA با کیت M5 Sprint qPCR RT (Toyobo، ژاپن) طبق دستورالعمل سازنده ساخته شد و پنج برابر با آب تیمارشده با DEPC رقیق شد. پرایمرهای اختصاصی برای ژن مرجع و ژن‌های هدف با نرم‌افزار Primer Premier 6.0 (Premier Biosoft International، آمریکا) طراحی و توسط Sangon Biotech (شانگهای، چین) سنتز شد. توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تشخیص ژن در STable 5 مواد تکمیلی آمده است. PCR کمی زمان واقعی با سامانه LightCycler® 96 (Roche، سوئیس) انجام شد. شرایط PCR چنین بود: واسرشت‌سازی اولیه در ۹۵ درجه به مدت ۶۰ ثانیه، سپس ۴۰ چرخه ۹۵ درجه به مدت ۱۵ ثانیه و ۶۰ درجه به مدت ۶۰ ثانیه. همه واکنش‌های PCR سه‌تکراری انجام شد و β-actin به‌عنوان کنترل مرجع داخلی به کار رفت. سطح بیان ژن‌های هدف با روش 2^(-ΔΔCT) نرمالیزه شد.

وسترن بلات

۱۰۰ میلی‌گرم مخاط روده از فریزر ۸۰- درجه برداشته و در ۱ میلی‌لیتر بافر لیز Western و IP (حاوی PMSF) همگن شد. همگنا سپس ۱۵ دقیقه در ۴ درجه سانتریفیوژ شد و ۲۰۰ میکرولیتر از محلول رویی جمع‌آوری شد. غلظت پروتئین نمونه با کیت سنجش پروتئین BCA (Beyotime، چین) طبق دستورالعمل سازنده تعیین شد. ژل جداکننده ۱۰ درصد و ژل متراکم‌کننده ۵ درصد به‌ترتیب تهیه و ریخته شد. نشانگر (۳ میکرولیتر) و نمونه‌های پروتئین کل بارگذاری شدند و سپس الکتروفورز در ۱۰۰ ولت به مدت ۳۰ دقیقه در ژل متراکم‌کننده و ۱۲۰ ولت به مدت ۹۰ دقیقه در ژل جداکننده انجام شد. پروتئین‌ها در ۲۰۰ میلی‌آمپر به مدت ۹۰ دقیقه به غشای PVDF منتقل شدند. غشا سپس در شیر خشک بدون چربی ۵ درصد در ۳۷ درجه به مدت ۲ ساعت مسدود شد. پس از مسدودسازی، غشا با آنتی‌بادی‌های اولیه رقیق‌شده علیه TLR4، IKB-α، NF-κB و TNF-α (۱:۱۰۰۰، Abmart، چین) در ۴ درجه به مدت ۱۲ ساعت انکوبه شد. آنتی‌بادی‌های اختصاصی مورد استفاده در STable 6 فهرست شده است. غشا سه بار و هر بار ۵ دقیقه با TBST شسته شد، سپس با آنتی‌بادی ثانویه IgG بز ضدخرگوش کونژوگه با هورسرادیش پراکسیداز (۱:۱۰٬۰۰۰، Bioss Antibodies) در دمای اتاق به مدت ۱ ساعت انکوبه شد. سیگنال با کیت شیمی‌لومینسانس تقویت‌شده (Beyotime، چین) شناسایی شد و باندهای پروتئینی با اسکنر خاکستری (G:Box Chemi-XX، کمبریج، انگلستان) مشاهده شدند. شدت باندهای پروتئینی با نرم‌افزار Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics، مریلند) تحلیل شد و سطح بیان پروتئین به‌صورت نسبت چگالی نوری هر پروتئین هدف به β-actin کمّی شد.

رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس

بافت‌های جمع‌آوری‌شده ژژنوم و ایلئوم به‌ترتیب تثبیت، آب‌گیری و جاسازی شدند. برش‌ها با ضخامت ۵ تا ۸ میلی‌متر [طبق متن اصلی؛ احتمالاً میکرومتر] تهیه شد و سپس بازیابی آنتی‌ژن انجام گرفت. برای جلوگیری از اتصال غیراختصاصی، برش‌ها با بافر حاوی سرم یا آلبومین سرم گاوی (BSA) مسدود شدند. رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس به‌صورت تک‌رنگ انجام شد، یعنی هر لام تنها با یک آنتی‌بادی اولیه انکوبه شد و هر گروه دست‌کم سه تکرار داشت. آنتی‌بادی‌های اولیه مورد استفاده شامل claudin-2 (۱:۸۰۰)، occludin (۱:۸۰۰)، Mucin (۱:۵۰۰) و ZO-1 (۱:۵۰۰) (Proteintech، چین) بود. برش‌ها یک شب در ۴ درجه انکوبه شدند و آنتی‌بادی‌های اولیه متصل‌نشده با PBS کاملاً شسته شدند. سپس انکوباسیون یک‌ساعته با آنتی‌بادی ثانویه انجام شد. برای رنگ‌آمیزی هسته از DAPI استفاده شد و برش‌ها با میکروسکوپ بررسی شدند. تصاویر خاکستری از عکس‌های تک‌رنگ فلورسانس قرمز با نرم‌افزار Image-Pro Plus 6.0 تحلیل شد. چگالی نوری انتگرالی (IOD) و مساحت پیکسلی (AREA) هر تصویر مثبت اندازه‌گیری و میانگین چگالی (IOD/AREA) محاسبه شد.

تحلیل آماری

داده‌های به‌دست‌آمده از این آزمایش ابتدا با Excel 2021 سازمان‌دهی و سپس با SPSS 21.0 (IBM، آمریکا) تحلیل شد. نرمال بودن داده‌ها ابتدا با آزمون کولموگروف–اسمیرنوف ارزیابی شد و برای داده‌هایی که توزیع نرمال نداشتند آزمون‌های ناپارامتریک به کار رفت. شاخص‌های عملکرد تولیدی، نتایج الایزا، آمار ریخت‌شناسی روده کوچک، داده‌های qRT-PCR، داده‌های وسترن بلات و شاخص‌های استرس اکسیداتیو همگی با تحلیل واریانس یک‌طرفه و سپس مقایسه‌های چندگانه با روش دانکن تحلیل شدند.

نتایج

اثر استرس ایمنی ناشی از LPS در مرغ‌ها بر عملکرد رشد

نتایج عملکرد رشد جوجه‌های گوشتی از روز ۱ تا ۱۴ و روز ۱۵ تا ۲۸ در شکل ۲ نشان داده شده است. پیش از تحریک با LPS (روزهای ۱ تا ۱۴)، بین گروه‌های تیماری در میانگین افزایش وزن روزانه (ADG)، میانگین مصرف خوراک روزانه (ADFI) و ضریب تبدیل خوراک (FCR) تفاوت معناداری وجود نداشت (P > 0٫05). پس از تحریک با LPS، در مقایسه با گروه شاهد، گروه LPS کاهش معنادار ADFI و ADG و افزایش معنادار FCR نشان داد (P < 0٫05). پس از مداخله طولانی‌مدت موسیقی، گروه MUS+LPS در مقایسه با گروه LPS افزایش معناداری در ADG و ADFI نشان داد (P < 0٫05)، اگرچه تفاوت معناداری در FCR نبود (P > 0٫05). در مقایسه با گروه شاهد، گروه MUS+LPS همچنان در ADG و ADFI تفاوت معنادار داشت (P < 0٫05) اما در FCR نداشت (P > 0٫05). از روز ۱۵ تا ۲۸، گروه MUS نسبت به گروه شاهد گرایش به ADG، ADFI و FCR بالاتر نشان داد، هرچند این تفاوت‌ها از نظر آماری معنادار نبود (P > 0٫05).

[محل شکل ۲] شکل ۲. تعدیل بلندمدت موسیقایی اثر حمله لیپوپلی‌ساکارید بر عملکرد رشد جوجه‌های گوشتی. (A) میانگین افزایش وزن روزانه (ADG) جوجه‌ها در دوره‌های ۱ تا ۱۴ و ۱۵ تا ۲۸ روزگی. (B) میانگین مصرف خوراک روزانه (ADFI) جوجه‌ها در دوره‌های ۱ تا ۱۴ و ۱۵ تا ۲۸ روزگی. (C) ضریب تبدیل خوراک. ستون‌های بدون حرف مشترک تفاوت معنادار دارند (P < 0٫05).

اثر تسکین بلندمدت موسیقایی LPS بر تغییرات بافت‌شناختی و ساختاری ژژنوم-ایلئوم

نتایج SEM بافت ژژنوم و ایلئوم جوجه‌ها در شکل ۳A ارائه شده است. در ژژنوم و ایلئوم، پرزهای روده در گروه‌های شاهد و MUS انگشتی‌شکل بودند و نسبتاً منظم و متراکم آرایش یافته بودند. در ژژنوم گروه شاهد، پرزها آسیب جزئی داشتند، در حالی که در ژژنوم گروه MUS و نیز ایلئوم هر دو گروه شاهد و MUS، سطح پرزها نسبتاً صاف بود و بیشتر آن‌ها جدا شدگی یا آسیبی نشان نمی‌دادند. در ژژنوم گروه LPS، پرزها توزیع نامنظم، جدا شدگی آشکار، سطح ناهموار و تعداد کاهش‌یافته داشتند. در گروه MUS+LPS، پرزها منظم‌تر آرایش یافته بودند، اما در مجموع شل به نظر می‌رسیدند و بخش کوچکی جدا شدگی داشت. در ایلئوم، گروه LPS پرزهای پراکنده با بی‌نظمی موضعی و آسیب سطحی قابل‌توجه نشان داد. در گروه MUS+LPS پرزها پراکنده بودند، اما در مقایسه با گروه LPS سطح آن‌ها صاف‌تر و بدون آسیب بود، هرچند مقداری جدا شدگی وجود داشت. نتایج TEM که ریخت‌شناسی سلولی بافت ژژنوم و ایلئوم جوجه‌ها را نشان می‌دهد در شکل ۳B ارائه شده است. در ژژنوم، گروه‌های شاهد و MUS مرزهای سلولی مشخص، اتصالات سلولی محکم و میتوکندری‌های فراوان در اطراف سلول‌ها داشتند که با کریستاهای میتوکندریایی متراکم و سالم مشخص می‌شدند. در گروه LPS، تراکم غشای هسته، فضاهای بین‌سلولی بزرگ، واکوئله‌شدن آشکار و شکستگی کریستاهای میتوکندری همراه با تراکم چشمگیر کروماتین مشاهده شد. در گروه MUS+LPS، برخی غشاهای سلولی نسبتاً سالم مانده بودند، اما تعداد میتوکندری‌ها کاهش یافته بود. در ایلئوم، گروه‌های شاهد و MUS چگالی الکترونی یکنواخت و بدون تغییر پاتولوژیک مهم نشان دادند. غشای هسته صاف بود، کروماتین به‌طور یکنواخت در هسته توزیع شده بود و ساختار میتوکندری با کریستاهای واضح سالم بود. در گروه LPS، شکستگی کریستاها، واکوئله‌شدن برخی میتوکندری‌ها و کاهش چشمگیر حجم میتوکندری مشاهده شد. در گروه MUS+LPS، اگرچه شکستگی کریستاها همچنان آشکار بود، شدت آسیب نسبت به گروه LPS کاهش یافته بود.

سطح سرمی دی‌آمین اکسیداز (DAO) و D-لاکتیک اسید (D-LA) در جوجه‌های گوشتی

وقتی عملکرد سد مخاطی روده مختل شود، DAO به خون آزاد می‌شود. به‌طور مشابه، وقتی عملکرد سد روده‌ای از دست برود، نفوذپذیری افزایش می‌یابد و مقادیر زیادی D-لاکتیک اسید توسط باکتری‌های روده تولید می‌شود. بنابراین اندازه‌گیری سطح DAO و D-LA در سرم اهمیت داشت. همان‌طور که در شکل ۳C نشان داده شده است، در مقایسه با گروه شاهد، سطح سرمی DAO و D-LA در گروه استرس القاشده با LPS به‌طور معناداری افزایش یافت (P < 0٫05). پس از مداخله موسیقی، سطح DAO و D-LA در گروه MUC+LPS در مقایسه با گروه LPS روند کاهشی معناداری نشان داد (P < 0٫05). در مقایسه با گروه شاهد، سطح D-LA در گروه MUC تفاوت معناداری نداشت (P > 0٫05)، در حالی که سطح DAO روند کاهشی معناداری نشان داد (P < 0٫05). این نتایج نشان داد که تزریق LPS می‌تواند تغییراتی در نفوذپذیری بافت روده ایجاد کند و مداخله موسیقی می‌تواند تغییرات نفوذپذیری روده ناشی از LPS را به‌طور مؤثر کاهش دهد.

[محل شکل ۳] شکل ۳. (A) تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) از ژژنوم و ایلئوم (SU8010، ۵٫۰ کیلوولت، ۸٫۰ میلی‌متر، بزرگنمایی ۱۲۰ برابر، ۴۰۰ میکرومتر). در ژژنوم گروه LPS، محل‌های آسیب با پیکان قرمز مشخص شده‌اند. در گروه MUS+LPS، محل‌های آسیب با پیکان سبز نشان داده شده‌اند. در ایلئوم، محل‌های آسیب در گروه LPS با پیکان آبی و در گروه MUC+LPS با پیکان بنفش مشخص شده‌اند. (B) نتایج میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) ژژنوم و ایلئوم (بزرگنمایی ۱۵٬۰۰۰ برابر). در ژژنوم گروه LPS، واکوئل‌ها با پیکان قرمز و اختلال کریستاهای میتوکندری با پیکان سبز مشخص شده‌اند. در ایلئوم گروه LPS، آسیب میتوکندری با پیکان آبی مشخص شده است. (C) سطح سرمی DAO و D-LA در جوجه‌های گوشتی. تفاوت‌های مشخص‌شده با حروف کوچک نشان‌دهنده تفاوت معنادار (P < 0٫05) و حرف یکسان نشان‌دهنده نبود تفاوت معنادار (P > 0٫05) است.

اثر LPS بر فعالیت آنتی‌اکسیدانی بافت ژژنوم-ایلئوم جوجه‌های گوشتی

استرس اکسیداتیو می‌تواند التهاب ایجاد کند و بررسی سازوکارهای بالقوه را در مدل‌های حیوانی ممکن سازد. برای بررسی بیشتر نقش LPS در القای استرس اکسیداتیو مرتبط با التهاب، پارامترهای مرتبط با استرس اکسیداتیو ارزیابی شد تا مشخص شود آیا استرس اکسیداتیو ناشی از LPS در ژژنوم و ایلئوم را می‌توان با موسیقی کاهش داد (شکل ۴A). در ژژنوم، در مقایسه با گروه شاهد، گروه LPS کاهش معنادار فعالیت SOD و GSH-Px نشان داد (P < 0٫05)، در حالی که سطح MDA به‌طور معناداری افزایش یافت (P < 0٫05). پس از مداخله طولانی‌مدت موسیقی، در مقایسه با گروه LPS، گروه MUS+LPS در فعالیت SOD تفاوت معناداری نشان نداد (P > 0٫05)، فعالیت GSH-Px افزایش معناداری داشت (P < 0٫05) و در سطح MDA تفاوت معناداری مشاهده نشد (P > 0٫05). در ایلئوم، در مقایسه با گروه شاهد، گروه LPS در فعالیت SOD تفاوت معناداری نداشت (P > 0٫05)، فعالیت GSH-Px کاهش معنادار و سطح MDA افزایش معنادار نشان داد (P < 0٫05). پس از مداخله موسیقی، در مقایسه با گروه LPS، گروه MUS+LPS در فعالیت SOD تفاوت معناداری نداشت (P > 0٫05)، اما سطح MDA به‌طور معناداری کاهش یافت (P < 0٫05).

بر پایه تحلیل دقیق این نشانگرهای استرس اکسیداتیو، به‌روشنی نشان داده شد که LPS به‌طور معناداری استرس اکسیداتیو را در ژژنوم و ایلئوم القا می‌کند. با این حال، هنگام ارزیابی اثرات موسیقی‌درمانی بلندمدت در کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از LPS، نتایج نشان داد که اثرات تسکینی آن نسبتاً محدود بود و تنها بهبود عمومی مشاهده شد. سطح فعال‌سازی ACTH مستقیماً بر ترشح CORT اثر می‌گذارد و این هورمون به‌نوبه خود به‌طور غیرمستقیم بر سطح استرس اکسیداتیو روده تأثیر دارد. بر این اساس، سطح CORT و ACTH ارزیابی شد. یافته‌ها نشان داد که گروه MUS در مقایسه با گروه شاهد سطح CORT به‌طور معناداری کاهش‌یافته‌ای داشت (P < 0٫05). در مقابل، گروه LPS نسبت به شاهد افزایش قابل‌توجهی در سطح CORT نشان داد (P < 0٫05). پس از مداخله موسیقی، بین گروه MUS+LPS و گروه LPS تفاوت معناداری مشاهده نشد (P > 0٫05). سطح ACTH در گروه LPS نسبت به گروه شاهد به‌طور معناداری بالا رفت (P < 0٫05). پس از مداخله موسیقی، گروه MUS+LPS با سه گروه دیگر تفاوت معناداری نشان نداد (P > 0٫05). این یافته‌ها نشان می‌دهد که LPS پاسخ‌های استرسی را در بدن برمی‌انگیزد. در چنین شرایط استرسی، ACTH و CORT به‌طور مشترک بر فرایندهای فیزیولوژیک اثر می‌گذارند و بالقوه استرس اکسیداتیو روده را از طریق اثر بر یکپارچگی سد روده‌ای تنظیم می‌کنند.

اثرات LPS و تحریک موسیقایی بر بیان ژن‌ها و پروتئین‌های مرتبط با تشکیل اتصال محکم

پروتئین‌های اتصال محکم نقش حیاتی در حفظ یکپارچگی و عملکرد سدهای فیزیولوژیک مختلف دارند. بنابراین PCR کمی زمان واقعی و ایمونوفلورسانس برای بررسی اثرات بر بیان ژن‌ها و پروتئین‌های مرتبط با تشکیل اتصال محکم به کار رفت (شکل ۴C و D).

همان‌طور که در شکل ۴C و D نشان داده شده است، القای LPS یکپارچگی سد روده‌ای را در ژژنوم و ایلئوم به‌طور معناداری مختل کرد. در ژژنوم، تزریق LPS به کاهش معنادار بیان mRNA پروتئین‌های اتصال محکم occludin، mucin2 و ZO-1 انجامید، در حالی که بیان mRNA ژن claudin-2 به‌طور معناداری افزایش یافت (P < 0٫05)، که نشان‌دهنده افزایش نفوذپذیری سد است. مداخله موسیقی این روند را به‌طور مؤثر تعدیل کرد: در گروه MUC+LPS در ژژنوم، سطح بیان mRNA و پروتئین occludin، mucin2 و ZO-1 در مقایسه با گروه LPS به‌طور معناداری افزایش یافت، در حالی که بیان claudin-2 به‌طور معناداری سرکوب شد (P < 0٫05)، که نشان‌دهنده بازگشت عملکرد سد است. در ایلئوم، LPS به‌طور مشابه بیان mRNA ژن claudin-2 را به‌طور معناداری افزایش و بیان mRNA ژن occludin را کاهش داد (P < 0٫05). مداخله موسیقی این اثر را به‌طور معناداری معکوس کرد، به‌طوری که بیان mRNA ژن claudin-2 در گروه MUS+LPS به‌طور معناداری کاهش و بیان mRNA ژن occludin به‌طور معناداری افزایش یافت (P < 0٫05). در مجموع، موسیقی با تنظیم دوسویه بیان پروتئین‌های کلیدی اتصال محکم، اختلال عملکرد سد روده‌ای ناشی از LPS را به‌طور مؤثر کاهش داد و اثر محافظتی خود را بر عملکرد سد روده‌ای نشان داد.

[محل شکل ۴] شکل ۴. اثرات مواجهه بلندمدت با موسیقی بر استرس اکسیداتیو، سد روده‌ای و نفوذپذیری روده در جوجه‌های گوشتی تزریق‌شده با لیپوپلی‌ساکارید (LPS). (A) فعالیت SOD، فعالیت GSH-Px و مقدار MDA. (B) غلظت CORT و ACTH. (C) بیان نسبی mRNA پروتئین‌های اتصال محکم (Claudin 2، Occludin، ZO-1) و پروتئین موسین Mucin 2 در مخاط ژژنوم و ایلئوم جوجه‌های گوشتی. (D) تصاویر ایمونوفلورسانس پروتئین‌های اتصال محکم (Claudin 2، Occludin، ZO-1) و پروتئین موسین Mucin 2 در مخاط ژژنوم و ایلئوم جوجه‌های گوشتی. نتایج آماری میانگین چگالی نوری پروتئین‌های اتصال محکم (Claudin 2، Occludin، ZO-1) و پروتئین موسین Mucin 2 در مخاط ژژنوم و ایلئوم زیر تصاویر ایمونوفلورسانس نشان داده شده است. تفاوت‌های مشخص‌شده با حروف کوچک نشان‌دهنده تفاوت معنادار (P < 0٫05) و حرف یکسان نشان‌دهنده نبود تفاوت معنادار (P > 0٫05) است.

نتایج سنجش مسیر سیگنالینگ التهابی TLR4/NF-κB

همان‌طور که در شکل ۵A نشان داده شده است، در مقایسه با گروه شاهد، سطح بیان mRNA ژن‌های TLR4، MYD88، NF-κB، TNF-α، IL-1β، IL-6 و IFN-γ در ژژنوم و ژن‌های TLR4، NF-κB، TNF-α، IL-1β و IL-6 در ایلئوم در گروه استرس القاشده با LPS به‌طور معناداری افزایش یافت (P < 0٫05). در مقایسه با گروه استرس القاشده با LPS، سطح بیان mRNA ژن‌های TLR4، NF-κB، TNF-α، IL-1β، IL-6 و IFN-γ در ژژنوم گروه MUC+LPS به‌طور معناداری کاهش و بیان mRNA ژن IL-10 به‌طور معناداری افزایش یافت (P < 0٫05). در ایلئوم، سطح بیان TLR4، NF-κB، IL-1β و IL-6 در گروه MUC+LPS در مقایسه با گروه استرس القاشده با LPS به‌طور معناداری کاهش یافت (P < 0٫05).

همان‌طور که در شکل ۵B نشان داده شده است، در مقایسه با گروه شاهد، سطح بیان پروتئین TLR4، NF-κB و TNF-α به‌طور معناداری افزایش و سطح بیان پروتئین IKB در گروه استرس القاشده با LPS هم در ژژنوم و هم در ایلئوم به‌طور معناداری کاهش یافت (P < 0٫05). در مقایسه با گروه استرس القاشده با LPS، سطح بیان پروتئین NF-κB و TNF-α در ژژنوم و ایلئوم در گروه MUC+LPS به‌طور معناداری کاهش یافت و هم‌زمان سطح بیان پروتئین IKB-α در ژژنوم به‌طور معناداری افزایش یافت (P < 0٫05).

همان‌طور که در شکل ۵C نشان داده شده است، در مقایسه با گروه شاهد، سطح IL-1β و IL-6 در مخاط ژژنوم و ایلئوم در گروه استرس القاشده با LPS به‌طور معناداری افزایش و سطح بیان IL-10 در ژژنوم به‌طور معناداری کاهش یافت (P < 0٫05). در مقایسه با گروه استرس القاشده با LPS، سطح IL-1β و IL-6 در ژژنوم و ایلئوم به‌طور معناداری کاهش و سطح IL-10 در ژژنوم در مرغ‌های دچار چالش LPS در محیط موسیقایی به‌طور معناداری افزایش یافت (P < 0٫05). نتایج بیان پروتئین با یافته‌های بیان ژن سازگار بود. این نتایج آزمایشی نشان داد که LPS فعال‌سازی مسیر سیگنالینگ NF-κB را القا کرد و تحریک موسیقایی می‌تواند مسیر سیگنالینگ NF-κB را سرکوب کند.

[محل شکل ۵] شکل ۵. موسیقی پتانسیل ضدالتهابی دارد و می‌تواند با مهار مسیر سیگنالینگ TLR4/NF-κB برانگیخته‌شده توسط LPS، التهاب ژژنوم و ایلئوم را به‌طور مؤثر کاهش دهد. (A) سطح بیان نسبی mRNA مسیر سیگنالینگ التهابی TLR4/NF-κB و فاکتورهای التهابی مرتبط در ژژنوم و ایلئوم جوجه‌های گوشتی. (B) تصاویر ایمونوبلات و نتایج آماری مربوط به پروتئین‌های TLR4، IKB-α، NF-κB p65 و TNF-α در ژژنوم و ایلئوم جوجه‌های گوشتی. (C) نتایج اندازه‌گیری سطح IL-1β، IL-6 و IL-10 در ژژنوم و ایلئوم جوجه‌های گوشتی در گروه‌های مختلف. تفاوت‌های مشخص‌شده با حروف کوچک نشان‌دهنده تفاوت معنادار (P < 0٫05) و حرف یکسان نشان‌دهنده نبود تفاوت معنادار (P > 0٫05) است.

بحث

LPS که یک پیروژن درون‌زاد است، می‌تواند به کمپلکس گیرنده لیپوپلی‌ساکارید در غشای سلول متصل شود، ترشح سیتوکین‌های پیش‌التهابی را توسط سلول‌های التهابی تقویت کند و پاسخ ایمنی قوی برانگیزد (Gauthier et al., 2022). نشان داده شده که مواجهه با LPS به آسیب اتصالات محکم و نازک شدن لایه مخاطی در روده کوچک طیور می‌انجامد و استرس اکسیداتیو و کاهش عملکرد تولیدی را به دنبال دارد (Wang et al., 2022; Feng et al., 2023). برای مثال، تزریق درون‌صفاقی LPS (۵۰۰ میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن) به جوجه‌های گوشتی در روزهای ۱۶، ۱۸ و ۲۰ به کاهش معنادار ADG و ADFI و افزایش FCR از روز ۱۶ تا ۲۱ انجامید. به‌طور مشابه، مطالعات نشان داده‌اند که LPS با دوز ۵۰۰ میلی‌گرم بر کیلوگرم افزایش وزن جوجه‌های گوشتی را در سنین ۱۴ تا ۱۵ و ۱۷ تا ۱۹ روزگی به‌طور معناداری مختل کرد و با کاهش مصرف خوراک در این دوره‌های حساس رشد (۱۴ تا ۱۵، ۱۵ تا ۱۷ و ۱۷ تا ۱۹ روزگی) همراه بود (Tan et al., 2023). نتایج پژوهش حاضر با مطالعات پیشین بسیار سازگار است و هر دو نشان می‌دهند که تزریق LPS اثر مهاری معناداری بر عملکرد رشد جوجه‌های گوشتی دارد. به‌طور مشخص، پس از تزریق درون‌صفاقی ۵۰۰ میلی‌گرم بر کیلوگرم LPS به جوجه‌های گوشتی در ۱۴ تا ۲۸ روزگی، کاهش معنادار ADG و ADFI و افزایش معنادار FCR مشاهده شد. این یافته‌ها بیشتر تأیید می‌کند که پاسخ التهابی ناشی از LPS اثر منفی بر عملکرد جوجه‌های گوشتی دارد و مبنای تجربی مهمی برای بررسی بیشتر سازوکارهای پیوند‌دهنده استرس التهابی و عملکرد رشد فراهم می‌کند. به‌طور مشابه، این نتایج نشان می‌دهد که مدل‌سازی استرس ایمنی با موفقیت انجام شد و می‌توان از آن در مطالعات بعدی درباره اثرات موسیقی بر سلامت جوجه‌های گوشتی استفاده کرد. آسیب LPS به عملکرد رشد جوجه‌های گوشتی را می‌توان به تخلیه انرژی و مواد مغذی ناشی از استرس ایمنی نسبت داد که رشد و نمو طبیعی آن‌ها را مختل می‌کند. مطالعات نشان داده‌اند که موسیقی شاد می‌تواند اثر مثبتی بر اشتها و رفتار تغذیه‌ای حیوانات داشته باشد (Spence, 2012). در این مطالعه دریافتیم که مداخله موسیقی در کاهش افت ADG و ADFI ناشی از LPS در جوجه‌های گوشتی مؤثر بود، اما آن‌ها را کاملاً به سطح طبیعی بازنگرداند. نکته قابل‌توجه این است که موسیقی افزایش FCR ناشی از LPS را به‌طور معناداری بهبود نداد. این یافته بیشتر با یافته‌های پیشین سازگار است که نشان می‌دهد تحریک موسیقایی با القای حالت هیجانی مثبت که لذت حیوان و ترجیح کلی او برای غذا را افزایش می‌دهد، تا حدی اثرات منفی استرس ایمنی بر رفتار تغذیه‌ای را خنثی می‌کند (Mathiesen et al., 2020). اگرچه موسیقی پتانسیلی برای بهبود رفاه جوجه‌های گوشتی نشان می‌دهد، اثر ترمیمی آن بر عملکرد رشد محدود باقی می‌ماند، که نشان می‌دهد برای بهینه‌سازی کامل مدیریت استرس در آینده ترکیبی از راهبردهای مداخله چندبُعدی لازم خواهد بود.

رشد جامع دستگاه گوارش در جوجه‌های گوشتی نقش حیاتی و تعیین‌کننده‌ای در ظرفیت هضم و جذب بعدی آن‌ها دارد (Ravindran and Abdollahi, 2021). روده کوچک به‌عنوان جزء اصلی فرایند هضم و جذب، پیش‌نیاز ضروری برای هضم و جذب کارآمد مواد مغذی به منظور ارتقای رشد بهینه جوجه‌های گوشتی است، زیرا مخاط روده سالم و دارای ساختار دست‌نخورده ضروری است (Montoro-Huguet et al., 2021). در این پژوهش، اثر منفی تحریک LPS بر ساختار ریخت‌شناختی روده را تأیید کردیم. مشاهدات میکروسکوپ الکترونی روبشی نشان داد که در مقایسه با گروه استرس ایمنی القاشده با LPS، گروه MUS+LPS پرزهای بلندتر و منظم‌تری در ژژنوم و ایلئوم داشت، که نشان‌دهنده رشد بهتر است. مشاهدات فراساختاری نشان داد که گروه‌های شاهد، MUS و MUS+LPS هسته‌های سلولی سالم، هسته‌چه‌های برجسته و مرزهای سلولی واضح داشتند، در حالی که گروه LPS در بافت ژژنوم و ایلئوم حاشیه‌ای شدن هسته‌چه‌ها و وجود واکوئل‌های آشکار در سیتوپلاسم را نشان داد. بنابراین محیط غنی‌شده با موسیقی آسیب به ساختار ریخت‌شناختی روده ناشی از استرس ایمنی القاشده با LPS در جوجه‌های گوشتی را کاهش داد. DAO آنزیم درون‌سلولی بسیار فعالی است که توسط سلول‌های اپیتلیال روده ترشح می‌شود (Kettner et al., 2022). در برخی موارد، نکروز و ریزش سلول‌های مخاطی روده به درون مجرای روده می‌تواند به افزایش فعالیت DAO در مجرا بینجامد (Hou et al., 2012). DAO همچنین می‌تواند وارد فضاهای بین‌سلولی، لنف و جریان خون سد مخاطی شود و به افزایش چشمگیر سطح DAO پلاسما بینجامد (Ji et al., 2013). D-LA محصول نهایی متابولیسم باکتری‌های روده است و وقتی سد روده‌ای آسیب ببیند می‌تواند از طریق اپیتلیوم روده وارد جریان خون شود و غلظت خونی آن را بالا ببرد (Ma et al., 2022). بنابراین تغییرات سطح DAO و D-LA پلاسما شاخص‌های ایده‌آلی برای نفوذپذیری روده و آسیب عملکرد مخاطی هستند (Ouyang et al., 2023). این پژوهش نشان داد که تحریک LPS سطح سرمی DAO و D-LA را در جوجه‌های گوشتی به‌طور معناداری افزایش داد، که به‌طور غیرمستقیم نشان می‌دهد LPS می‌تواند ساختار مخاطی روده و عملکرد سد را به‌شدت آسیب برساند. در مقایسه با گروه LPS، گروه MUC+LPS سطح سرمی DAO و D-LA به‌طور معناداری پایین‌تری داشت، که نشان می‌دهد محیط موسیقایی تا حدی می‌تواند آسیب به ساختار مخاطی روده و عملکرد سد ناشی از تحریک LPS را بهبود دهد. این مشاهدات نشان می‌دهد که مواجهه بلندمدت با موسیقی می‌تواند عملکرد گوارشی و جذبی روده را بهبود دهد و بدین‌وسیله جذب مواد مغذی را تقویت کند و عملکرد رشد را ارتقا دهد.

متابولیسم هوازی که برای بقای سلول‌های حیوانی ضروری است، گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)، عمدتاً رادیکال‌های آزاد مانند سوپراکسید و هیدروکسیل، تولید می‌کند (Checa and Aran, 2020). عدم تعادل میان تولید رادیکال آزاد و دفاع آنتی‌اکسیدانی درون‌زاد در سلول‌ها یا بافت‌ها می‌تواند به استرس اکسیداتیو بینجامد که آسیب زیستی و اختلالات فیزیولوژیک گوناگون ایجاد می‌کند و با تداوم پاسخ‌های التهابی و سلامت روده ارتباط نزدیک دارد (Vona et al., 2021; Sahoo et al., 2023). ما شاخص‌های مرتبط با استرس اکسیداتیو را ارزیابی کردیم. نتایج ما نشان داد که LPS می‌تواند پاسخ استرس اکسیداتیو را در جوجه‌های گوشتی به‌طور معناداری القا کند، که با کاهش فعالیت SOD و GSH-Px و افزایش مقدار MDA در مخاط ژژنوم و ایلئوم مشهود بود. در مقابل، جوجه‌های گوشتی در محیط موسیقایی فعالیت SOD و GSH-Px افزایش‌یافته و مقدار MDA کاهش‌یافته‌ای در مخاط ژژنوم و ایلئوم داشتند. تولید بیش‌ازحد رادیکال‌های آزاد عامل محرک اصلی فعال‌سازی مسیرهای التهابی است (Di Meo and Venditti, 2020; Unsal et al., 2021)؛ بنابراین فرض می‌کنیم که موسیقی کلاسیک ممکن است با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی و تضعیف پراکسیداسیون لیپیدی در روده جوجه‌های گوشتی در تولید رادیکال آزاد اختلال ایجاد کند و بدین‌ترتیب پتانسیل آنتی‌اکسیدانی خود را اعمال کند. این یافته‌های پژوهش با مطالعات پیشین سازگار است و نشان می‌دهد مواجهه بلندمدت با موسیقی اثر کاهنده بر استرس اکسیداتیو دارد (Mishra and Jha, 2019; Zhang et al., 2023).

حفظ و بهینه‌سازی عملکرد سد روده‌ای برای سلامت جوجه‌های گوشتی اهمیت زیادی دارد (Zhu et al., 2021). اپیتلیوم روده سدهای فیزیکی و شیمیایی ایجاد می‌کند تا از انتشار آنتی‌ژن‌هایی مانند پاتوژن‌ها از مجرای روده به بافت‌های مخاطی جلوگیری کند (Gierynska et al., 2022). لیپوپلی‌ساکارید بیان‌شده بر غشای خارجی باکتری‌های گرم‌منفی می‌تواند با فعال‌سازی گیرنده‌های شبه‌Toll بیان Mucin2 را فعال کند (Burgueno and Abreu, 2020) و در موش‌های فاقد Mucin2 بروز خودبه‌خودی کولیت و افزایش حساسیت به سرطان کولورکتال ناشی از التهاب مشاهده شده است (Tadesse et al., 2017; Gundamaraju and Chong, 2021). اتصالات محکم کمپلکس‌های چندپروتئینی هستند که در انتهای رأسی غشای جانبی سلول‌های اپیتلیال قرار دارند و خانواده‌های claudin و occludin و نیز پروتئین‌های پلاک درون‌سلولی مانند zonula ZO اجزای مهم ساختار اتصال محکم هستند (Zihni et al., 2016). نتایج ما نشان داد که تحریک LPS بیان mRNA و پروتئین Mucin2 را در ژژنوم به‌طور معناداری کاهش داد. مطالعات نشان داده‌اند که استرس اکسیداتیو و آپوپتوز سلول‌های جامی ناشی از LPS ممکن است بیان Mucin2 را مختل و در نهایت سد مخاطی روده را تخریب کند. در مقابل، این پژوهش نشان داد که محیط موسیقایی بیان پروتئین Mucin2 را در ژژنوم جوجه‌های گوشتی تحت استرس ایمنی ناشی از LPS افزایش داد، که نشان می‌دهد محیط موسیقایی می‌تواند آسیب عملکرد سد روده‌ای ناشی از LPS را بهبود دهد، و این ممکن است به توانایی محیط موسیقایی در افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، کاهش استرس اکسیداتیو و آپوپتوز سلول‌های جامی و بازگرداندن بیان موسین‌ها مرتبط باشد. افزون بر این، تحریک LPS بیان mRNA و پروتئین پروتئین‌های ساختاری اتصال محکم را مختل کرد. بیان پروتئین‌های اتصال محکم نقش حیاتی در حفظ یکپارچگی سد روده‌ای و تضمین عملکرد طبیعی سد دارد. افزایش بیان پروتئین Claudin-2 عامل مهمی در بیماری التهابی روده شناخته شده است. وانگ و همکاران دریافتند که بیان mRNA پروتئین‌های اتصال محکم Occludin و ZO-2 در ژژنوم جوجه‌های گوشتی تیمارشده با LPS کاهش یافته بود (Wang et al., 2014). در مطالعه‌ای درباره اثر اشریشیا کولی بیماری‌زا بر برهمکنش و جایگاه‌یابی پروتئین‌های اتصال محکم، میشل و همکاران تغییرات ساختاری در پروتئین‌های Z0-1، Occludin و Claudin-1 را همراه با از دست رفتن عملکرد سد در سلول‌های اپیتلیال روده انسانی (T84) آلوده به اشریشیا کولی بیماری‌زا یافتند (Luo et al., 2012). در مقایسه با گروه استرس ایمنی القاشده با LPS، تحریک موسیقایی در بازگرداندن سطح بیان پروتئین و mRNA ژن‌های Occludin و ZO-1 در مخاط روده جوجه‌های گوشتی مفید بود. این امر نشان می‌دهد که محیط غنی‌شده با موسیقی اثر محافظتی در برابر اختلال عملکرد سد روده‌ای ناشی از LPS دارد و یک سد روده‌ای سالم می‌تواند از ورود مواد زیان‌آور مجرای روده به گردش خون سیستمیک جلوگیری کند، که با کاهش سطح سرمی DAO و D-LA در جوجه‌های گوشتی تحت محیط موسیقایی تأیید می‌شود. این نتایج بیش از پیش این دیدگاه را تقویت می‌کند که محیط موسیقایی می‌تواند اختلال عملکرد سد روده‌ای ناشی از LPS را در جوجه‌های گوشتی کاهش دهد.

آسیب سد روده‌ای اغلب توسط پاتوژن‌ها یا سموم برانگیخته می‌شود و این فرایند معمولاً با التهاب چشمگیر همراه است (Awad et al., 2017). LPS به‌عنوان لیگاند کلیدی TLR4 نقش محوری در آغاز واکنش آبشاری التهابی وابسته به NF-κB دارد (Tong et al., 2020). به‌طور مشخص، وقتی LPS به دامنه خارج‌سلولی TLR4 متصل می‌شود، این برهمکنش مجموعه‌ای از واکنش‌های آبشاری پیچیده انتقال سیگنال درون‌سلولی را برمی‌انگیزد (Ciesielska et al., 2021). نتایج ما نشان داد که تحریک LPS بیان mRNA ژن‌های TLR4، MyD88، TRAF6، NF-κB p65، TNF-α، IL-1β و IL-6 را افزایش و بیان mRNA ژن IKB را در مخاط ژژنوم و ایلئوم کاهش داد، که به جدا شدن بیشتر IKB از NF-κB انجامید. در مقابل، تحریک موسیقایی بیان mRNA ژن‌های TLR4، MyD88 و TRAF6 را کاهش و بیان mRNA ژن IKBα را افزایش داد و بدین‌وسیله بیان بیش‌ازحد mRNA ژن NF-κB p65 را سرکوب کرد. این نشان می‌دهد که محیط موسیقایی می‌تواند نقش مثبتی در کاهش تولید بیش‌ازحد سیتوکین‌های پیش‌التهابی ایفا کند. برای تأیید بیشتر اثرات مشاهده‌شده تحریک موسیقایی بر تنظیم مسیر سیگنالینگ TLR4/NF-κB و پاسخ التهابی پایین‌دست، بیان پروتئین TLR4، زیرواحد NF-κB p65، IKB و TNF-α را در مخاط ژژنوم و ایلئوم سنجیدیم. نتایج نشان داد که محیط موسیقایی می‌تواند افزایش بیان TLR4 ناشی از LPS، انتقال هسته‌ای NF-κB p65، تخریب پروتئین IKB و آزادسازی فاکتورهای التهابی مانند TNF-α، IL-1β و IL-6 را مهار کند. اگرچه موسیقی می‌تواند آسیب روده ناشی از LPS را به‌طور مؤثر کاهش دهد، معکوس شدن کامل آسیب مشاهده نشد. این یافته‌ها نشان می‌دهد که موسیقی می‌تواند بیان فاکتورهای التهابی را از طریق تنظیم مسیر سیگنالینگ NF-κB تعدیل کند، هرچند اثر آن بر کاهش التهاب روده ناشی از LPS محدود است. متأسفانه محدودیت‌های فضایی آزمایشگاه مانع شبیه‌سازی محیط‌های پرورش در مقیاس بزرگ شد. افزون بر این، این پژوهش تنها بر چگونگی اثر موسیقی بر مسیر سیگنالینگ NF-κB پس از مواجهه با LPS برای تنظیم سطح التهاب روده تمرکز داشت و اثرات تنظیمی موسیقی بر سایر مسیرها هنوز نامشخص است. در آینده، هدف ما بررسی بیشتر این است که آیا مواجهه با LPS با القای استرس اکسیداتیو سایر مسیرها مانند PLC-PKC و MAPK را تعدیل می‌کند. امیدواریم رابطه پیچیده میان استرس ناشی از LPS و پاسخ ایمنی در طیور و نقش تنظیمی مثبت موسیقی در این فرایند را روشن کنیم و پایه علمی محکمی برای بهینه‌سازی محیط‌های پرورش، کاهش پاسخ‌های استرسی و ارتقای سلامت کلی گله و عملکرد تولیدی فراهم کنیم.