آلرژی به میگو یک واکنش آلرژیک رایج در سراسر جهان است و در سال‌های اخیر جدی‌تر شده است، ممکن است واکنش‌های آلرژیک شدیدی را ایجاد کند و معمولاً در طول زندگی ادامه یابد. آلرژن اصلی در میگو به عنوان تروپومیوزین (TM) شناسایی شد که از دو زنجیره آلفا -مارپیچ یکسان که در یک ساختار ثانویه مارپیچ-پیچیده قرار گرفته‌اند، با 284 اسید آمینه و وزن مولکولی 35 تا 40 کیلو دالتون تشکیل شده است ( Gámez و همکاران، 2015؛ Liu و همکاران، 2010؛ Lu، 2016 ). بیماران مبتلا به آلرژی به میگو، پاسخ ایمنی به تروپومیوزین داشتند که به IgE اختصاصی میگو از بیماران مبتلا به آلرژی به میگو متصل می‌شد ( Lu، 2016 ).
تایهو ( Exopalaemon modestus ) یک میگوی آب شیرینمیگوی آب شیرین معروف بومی دریاچه تایهو است و مدت‌هاست که با ارزش غذایی بالا و خواص آشپزی، یک غذای لذیذ و مد روز در استان‌های جیانگ سو و ژجیانگ چین بوده است. این نوع میگو، بازار قابل توجهی از ماهی آب شیرین را با تولید انبوه تشکیل می‌دهد . در حالی که به دلیل افزایش مصرف آن در سال‌های اخیر، بروز واکنش‌های آلرژیک نیز رو به افزایش بوده است. کاهش آلرژن اصلی آن برای افراد مبتلا به آلرژی به میگو مفید خواهد بود . با این حال، تاکنون هیچ داده‌ای در مورد آنتی‌ژن بودن و نحوه کاهش مؤثر آنتی‌ژن بودن تروپومیوزین از میگوی تایهو در دسترس نبود .
در میان اقدامات برای کاهش آنتی‌ژنیسیته میگو، سونوگرافی با شدت بالا (HIU، 16 تا 100 کیلوهرتز، توان 10 تا 1000 وات بر سانتی‌متر مربع ) به دلیل کاویتاسیون صوتی خود، یک فناوری امیدوارکننده در فرآوری مواد غذایی است. در طول سونیکاسیون، حباب‌های کاویتاسیون تشکیل می‌شوند که طی چند چرخه رشد می‌کنند و سپس به شدت فرو می‌ریزند و منجر به دمای بالا (5000 کلوین)، فشار (1000 اتمسفر)، امواج با انرژی برشی بالا و تلاطم در ناحیه کاویتاسیون می‌شوند ( هو، چونگ، پان و لی-چان، 2015 )، که ترکیب پروتئین‌ها را تغییر می‌دهد ، ساختار پروتئین را شل می‌کند و حتی زنجیره‌های پپتیدی پروتئین‌ها را می‌شکند، بنابراین با تغییر اپی‌توپ‌های واکنشی یا خطی IgE، آنتی‌ژنیسیته را تغییر می‌دهد. مطالعات متعددی تأثیر سونیکاسیون بر ترکیب پروتئین‌های مختلف را بررسی کرده‌اند . جیانگ و همکاران . (2014) دریافتند که HIU صفحه β پروتئین ایزوله لوبیای سیاه را افزایش می‌دهد و Gülseren، Güzey ، Bruce و Weiss (2007) متوجه شدند که HIU چرخش β آلبومین سرم گاوی را کاهش می‌دهد. Stathopulos و همکاران (2004) اشاره کردند که HIU پروتئین، ساختار β را افزایش می‌دهد در حالی که ساختار α- مارپیچ را در تجمعات پروتئین کاهش می‌دهد . Hu و همکاران (2015) دریافتند که تیمار HIU می‌تواند ساختار سوم و چهارم پروتئین سویا را مختل کند. پروتئین ماهیچه‌ای تروپومیوزین، آلرژن اصلی شناسایی شده در میگو است ( Gámez و همکاران، 2015؛ Liu و همکاران، 2010 )، در حالی که گزارش‌های محدودی بر اثرات HIU بر پایداری ترکیب تروپومیوزین و در نتیجه آنتی‌ژن بودن آن متمرکز شده‌اند .
مقاومت در برابر هضم گوارشی یکی از ویژگی‌های رایج آلرژن‌های غذایی است که به آنها اجازه می‌دهد بدون تغییر از دستگاه گوارش عبور کنند و در نتیجه منجر به حفظ ساختار و شکل ظاهری آنها می‌شود.
یا اپی‌توپ‌های خطی برای اتصال به آنتی‌بادی‌ها و در نتیجه ایجاد پاسخ‌های آلرژیک ( Astwood, Leach, & Fuchs, 1996 ). مطالعات متعددی گزارش می‌دهند که تروپومیوزین یک پروتئین بسیار پایدار است ( Leung et al., 1994 ). با این حال، پایداری و تنوع آلرژی‌زایی تروپومیوزین میگو در هضم شبیه‌سازی شده دستگاه گوارش به خوبی شناخته نشده است. به همین دلیل، لازم است درک کاملی از چگونگی هضم تروپومیوزین در دستگاه گوارش و آنچه که بر پتانسیل آلرژی‌زایی آن تأثیر می‌گذارد، به دست آید تا آلرژی‌زایی میگو مدیریت شود.
کاهش آلرژی‌زایی تروپومیوزین برای افراد مبتلا به آلرژی به میگو مفید خواهد بود . در این کار، اهداف بررسی اثرات تیمار HIU بر پایداری ترکیب TM، آلرژی‌زایی، قابلیت هضم گوارشی و آلرژی‌زایی محصولات هضم گوارشی TM از Exopalaemon modestus بود. نتایج این کار درک ما را از مکانیسم کاهش آلرژی‌زایی تروپومیوزین توسط تیمار HIU افزایش می‌دهد، و همچنین نشان می‌دهد که تیمار HIU ممکن است یک روش جایگزین کارآمد برای کاهش حساسیت به تروپومیوزین باشد .
۲. مواد و روش‌ها
۲.۱ مواد
ماهی اگزوپالائمون مودستوس زنده (طول ۴۷.۷۶ ± ۳.۳۱ میلی‌متر، وزن ۱.۵۹ ± ۰.۲۷ گرم) در نانکوان خریداری شد. بازار شیر دریاچه تایهو ، ووشی، چین. ANS (8-آنیلینو-1-نفتالین سولفونیک اسید، CAS: 82-76-8)، DTNB (5، 5-دی تیوبیس [2-نیتروبنزوئیک اسید]، CAS: 69-783)، EDTA (اتیلن دی آمین تترا استیک اسید، CAS: 60-00-4)، پپسین (3411 واحد بر میلی گرم پروتئین، CAS: 9001-75-6)، تریپسین (13165 واحد بر میلی گرم پروتئین، CAS: 9002-07-7) و اوره (CAS: 57-13-6) از شرکت سیگما آلدریچ (سنت لوئیس، میزوری، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. مایع درخشان ECL و TMB ( تترا بنزیدین ) از شرکت Beyotime Technology Co., Ltd. (پکن، چین)، آنتی‌بادی IgE بز کونژوگه شده با پراکسیداز از شرکت KPL Inc. (گیثرزبورگ، مریلند، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. BSA (آلبومین سرم گاوی، CAS: 9048-46-8) از شرکت Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd (شانگهای، چین) تهیه شد. سایر مواد شیمیایی دارای درجه خلوص تحلیلی یا بالاتر بودند.
۲.۲ سرم بیماران
سرم بیماران مبتلا به آلرژی به میگو از بخش آزمایشگاه بالینی بیمارستان مردمی ووشی (ووشی، چین) تهیه و تا زمان تجزیه و تحلیل در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شد . پاسخ آلرژیک با تشخیص بالینی تأیید شد . مجموعه‌ای از سرم‌های بیماران انتخاب شده برای تشخیص ایمنی IgE استفاده شد. ده سرم از داوطلبان سالم (افراد غیر آلرژیک و غیر آتوپیک) به عنوان کنترل منفی استفاده شد.
۲.۳ استخراج و خالص‌سازی تروپومیوزین (TM)
ماهیچه‌های میگوی خام چرخ شده و با محلول بافر PBS 0.01 مولار (pH 7.4) در هموژنایزر (DS-1، کارخانه مدل نمونه شانگهای، شانگهای، چین) به میزان 4 برابر همگن شدند . پس از سانتریفیوژ با سرعت 10000 × g به مدت 15 دقیقه، مایع رویی دور ریخته شد و رسوب در محلول بافر PBS 0.01 مولار دوباره به حالت تعلیق درآمد و پس از آن هموژنیزاسیون و سانتریفیوژ انجام شد. شستشو، هموژنیزاسیون و سانتریفیوژ چهار بار تکرار شد تا پروتئین‌های سارکوپلاسمی به طور مؤثر حذف شوند . رسوب نهایی حاصل سپس سه بار با استون مطلق سرد ( -20 درجه سانتیگراد) شسته شد . پس از شستشوی نهایی ، باقیمانده‌ها روی کاغذ صافی پخش شده و به مدت یک شب خشک شدند.
پودر خشک‌شده در 8 برابر (وزنی/حجمی) از یک بافر دیگر ( 1 مولار KCl، 0.5 میلی‌مولار DTT، 20 میلی‌مولار Tris-HCl، pH 7.5) به حالت تعلیق درآمد و استخراج با هم زدن در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت یک شب انجام شد. محلول به مدت 15 دقیقه با سرعت 15000 × g سانتریفیوژ شد. محلول رویی از کاغذهای صافی عبور داده شد و سپس در pH 4.5 تنظیم‌شده با 1 مولار HCl تحت رسوب ایزوالکتریک قرار گرفت، به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد، سپس به مدت 15 دقیقه با سرعت 15000 × g سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل در PBS حل شد و یک بار دیگر در pH 4.5 با 1 مولار HCl تحت رسوب ایزوالکتریک قرار گرفت. رسوب ایزوالکتریک حاصل در PBS حل شد و با NaOH 1 مولار به pH 7.6 رسانده شد، سپس تحت جداسازی سولفات آمونیوم با اشباع 41٪ قرار گرفت، به مدت 4 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد و به مدت 15 دقیقه با سرعت 15000 × g سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل در PBS حل شد و به pH 7.6 رسانده شد، سپس یک بار دیگر تحت جداسازی سولفات آمونیوم با اشباع 41٪ قرار گرفت. رسوب در آب فوق خالص (NW15VF، سیستم تصفیه آب Heal Force ®، شرکت ابزار تحلیلی Canrex شانگهای، شانگهای، چین) در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت دیالیز شد و سپس به مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش گرم شد. پس از خنک شدن گسترده در آب یخ، محلول جوشیده به مدت 15 دقیقه با سرعت 15000 × g سانتریفیوژ شد، محلول رویی حاوی تروپومیوزین خالص شده از کاغذهای صافی عبور داده شد ، سپس با استفاده از خشک کن انجمادی خلاء ( BenchTop Pro، SP Scienti f ، Warminster، PA، USA) لیوفیلیزه و در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد . میزان پروتئین با استفاده از روش Biuret با BSA به عنوان استاندارد تعیین شد.
۲.۴ درمان با امواج فراصوت با شدت بالا (HIU)
تیمار HIU TM طبق گفته ژانگ، رگنشتاین، ژو و یانگ (2017) با برخی اصلاحات انجام شد . محلول TM (1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) با استفاده از یک پردازنده اولتراسوند (JY99- Ⅱ DN، 20 کیلوهرتز، شرکت Scientz Biotechnology، با مسئولیت محدود، نینگبو، چین) مجهز به یک پروب تیتانیومی با قطر 2.0 سانتی‌متر (که برای سونیکاسیون 25 میلی‌لیتر از محلول‌های TM در لوله‌های سانتریفیوژ 50 میلی‌لیتری غوطه‌ور در حمام آب یخ استفاده شد، تیمار شد. نمونه‌ها به مدت 15 دقیقه با توان‌های خروجی مختلف (100، 200، 300، 400، 500، 600، 700 و 800 وات) تیمار شدند ( مدت زمان پالس 5 ثانیه روشن و 1 ثانیه خاموش ) و نمونه‌های بدون تیمار اولتراسوند به عنوان کنترل در نظر گرفته شدند.
۲.۵ پایداری صورت‌بندی
۲.۵.۱ آنالیز اسید آمینه
تعیین محتوای اسید آمینه طبق روش Zhang, Yang, Zhou, Zhang, and Wang (2017) با کمی اصلاحات انجام شد . نمونه‌های TM لیوفیلیزه شده تحت تیمار HIU (0.1 گرم) با 8 میلی‌لیتر HCl 6 مولار در لوله‌های شیشه‌ای 10 میلی‌لیتری درپوش‌دار مخلوط شدند، لوله‌ها با گاز نیتروژن خالص پر شدند، سپس به مدت 22 ساعت در دمای 110 درجه سانتیگراد هیدرولیز شدند. پس از خنک شدن تا دمای اتاق (25 درجه سانتیگراد)، نمونه را از لوله به ظرف حجمی 25 میلی‌لیتری منتقل کردند و 4.8 میلی‌لیتر NaOH 10 مولار برای خنثی‌سازی هیدرولیز اسیدی اضافه کردند. دیواره داخلی ظرف را با مقدار کمی آب شستشو دادند، سپس با آب تا حجم 25 میلی‌لیتر رقیق کردند. بخشی از محلول با استفاده از دو برش کاغذ صافی صاف شده و به یک لوله سانتریفیوژ منتقل شد، به مدت 10 دقیقه با سرعت 10000 × g سانتریفیوژ شد، سپس 400 میکرولیتر از محلول رویی به بطری‌های نمونه HPLC منتقل شد. نمونه‌ها با استفاده از یک آنالیزور اسید آمینه خودکار (Agilent 1260، Agilent Technology، سانتا کلارا، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) برای آنالیز اسید آمینه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. محتوای اسید آمینه به صورت درصد وزنی (%) در کل مقدار اسید آمینه بیان شد.
۲.۵.۲ آنالیز کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
آنالیز HPLC TM تیمار شده با HIU با استفاده از یک Alliance HPLC (Waters e2695, Waters, Corp., Milford, MA, USA) با یک ستون BioSuite 125, 5 μ m , HR SEC (7.8 mm × 300 mm, Waters Corp., Milford, MA, USA) انجام شد. سیستم شستشو، PBS 0.01 M (pH 7.0) حاوی 0.15 M NaCl بود. سرعت جریان 1.0 میلی‌لیتر در دقیقه بود و آنالیز در دمای 20 درجه سانتیگراد انجام شد. پروتئین در طول موج 220 نانومتر با یک آشکارساز UV Waters 2489 (Waters Corp., USA) پایش شد. TM تیمار شده با HIU با حل کردن 1 میلی‌گرم پروتئین در 1 میلی‌لیتر PBS 0.01 M (pH 7.0) و تزریق آن به ستون (15 μ L ) تهیه شد . جمع‌آوری داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار Waters Empower 3 (شرکت Waters، ایالات متحده آمریکا) انجام شد.
۲.۵.۳ طیف‌های دورنگ‌نمایی دایره‌ای (CD)
طیف‌های CD دور-UV توسط یک طیف‌سنج MOS-450 ( Biologic Science Instruments، Claix ، فرانسه) در دمای 25 درجه سانتیگراد و با استفاده از یک کووت کوارتز با طول مسیر نوری 1 میلی‌متر ثبت شدند. نمونه‌های پروتئین (0.1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) از 190 تا 250 نانومتر با سرعت اسکن 100 نانومتر در دقیقه با گام طول موج 1 نانومتر اسکن شدند. از DichroWeb ( http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk ) برای تجزیه و تحلیل ساختارهای ثانویه پروتئین استفاده شد .
۲.۵.۴ آبگریزی سطح
آبگریزی سطح نمونه TM با استفاده از ANS به عنوان یک کاوشگر فلورسانس تعیین شد . محلول TM (1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) به مجموعه‌ای از محلول‌ها با غلظت‌های 0.1 تا 0.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر رقیق شد . 20 میکرولیتر از محلول ANS (8 میلی‌مولار ANS در بافر 0.1 مولار KH2PO4 ، pH 7.0) به 4 لیتر از محلول TM اضافه و خوب مخلوط شد. نمونه‌ها به مدت 20 دقیقه در تاریکی نگهداری شدند. شدت فلورسانس با استفاده از اسپکتروفتومتر فلورسانس (F-7000، شرکت هیتاچی، توکیو، ژاپن) تعیین شد . آبگریزی سطح (S0 – ANS) نمونه‌ها به عنوان شیب اولیه نمودار شدت فلورسانس در مقابل غلظت پروتئین تعریف شد که با تجزیه و تحلیل رگرسیون خطی محاسبه شد.
۲.۵.۵ محتوای گروه سولفیدریل (SH)
محتوای کل گروه SH به شرح زیر تعیین شد : 4.5 میلی‌لیتر از یک بافر حاوی اوره 8 مولار، KH2PO4 0.1 مولار و 10 میلی‌مولار EDTA (pH 7.0) و 100 میکرولیتر معرف المن (10 میلی‌مولار DTNB در بافر 0.1 مولار KH2PO4 ، pH 7.0 ) به 0.5 میلی‌لیتر محلول‌های TM (1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) اضافه شد. نمونه‌ها به مدت 25 دقیقه در تاریکی نگهداری شدند. جذب در طول موج 412 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-VIS (UV-2700، شرکت Shimadzu، کیوتو، ژاپن) اندازه‌گیری شد . گروه‌های SH واکنش‌پذیر به عنوان اندازه‌گیری کل گروه‌های SH با عدم وجود اوره محاسبه شدند. ضریب خاموشی مولار 13600 مولار – 1 سانتی‌متر – 1 برای محاسبه محتوای گروه SH استفاده شد.
۲.۵.۶ اندازه ذرات و پتانسیل زتا
یک میلی‌لیتر از محلول‌های TM (1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) برای اندازه‌گیری اندازه ذرات و پتانسیل زتا در سلول‌های زتا شفاف تزریق شد و با استفاده از دستگاه اندازه‌گیری ذرات و آنالیز پتانسیل زتا ( NanoBrook Omni, Brookhaven Instruments Corp., Holtsville, NY, USA) در سه تکرار تجزیه و تحلیل شد. داده‌های اندازه ذرات (نانومتر) و پتانسیل زتا (mV) به طور خودکار توسط نرم‌افزار Particle Solution 3.0 (Brookhaven Instruments Corp., Holtsville, NY, USA) گزارش شدند.
۲.۶ تجزیه و تحلیل آلرژی‌زایی
۲.۶.۱ الکتروفورز ژل پلی‌اکریل‌آمید سدیم-دودسیل سولفات (SDSPAGE )
محلول‌های TM (1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به نسبت 1:1 در محلول‌های بافر بارگذاری ( 25 میلی‌مولار Tris-HCl، 10٪ گلیسرول (حجمی/حجمی)، 2٪ SDS (وزنی/حجمی)، 1.54٪ DTT (وزنی/حجمی) و 0.1٪ بروموفنول آبی (وزنی/حجمی)) رقیق شده و قبل از ژل کردن، در دمای 95 درجه سانتیگراد، 3 دقیقه گرم شدند. در مورد SDS-PAGE، از یک ژل جداکننده 12٪ آکریل آمید و یک ژل انباشته‌کننده 4٪ آکریل آمید استفاده شد. مقدار نمونه بارگذاری شده در هر لاین برای هر کدام 10 میکرولیتر بود . در هر ژل از استانداردهای وزن مولکولی (10 تا 250 کیلو دالتون ) (Bio-Rad، فیلادلفیا، پنسیلوانیا، ایالات متحده آمریکا) استفاده شد. الکتروفورز در یک واحد عمودی (Mini-PROTEAN ® Tetra System، BIO-RAD، فیلادلفیا، پنسیلوانیا، ایالات متحده) با استفاده از بافر ( 50 میلی‌مولار Tris-HCl، 384 میلی‌مولار گلیسین و 0.1٪ SDS، pH 8.3) انجام شد .
الکتروفورز برای ژل متراکم در ولتاژ ۸۰ ولت و برای ژل جداکننده در ولتاژ ۱۲۰ ولت انجام شد. باندهای پروتئینی تثبیت و به مدت ۱ ساعت با کوماسی بریلیانت بلو (R-250) رنگ‌آمیزی شدند، سپس با محلولی حاوی ۵۰ میلی‌لیتر در لیتر متانول و ۷۵ میلی‌لیتر در لیتر اسید استیک رنگ‌آمیزی شدند.
۲.۶.۲. ایمونوبلاتینگ
پروتئین‌های ژل‌های الکتروفورز توسط یک سلول Mini Trans-Blot ® (Bio – Rad، فیلادلفیا، پنسیلوانیا، ایالات متحده آمریکا) با استفاده از سیستم بافر انتقال Tris-glycine به غشای PVDF (0.45 میکرومتر ، Merk Millipore Ltd.، Darmstadt، آلمان) منتقل شدند . غشا ابتدا با محلول نمکی حاوی Trisbu شسته شد و سپس به مدت 1 ساعت در دمای 25 درجه سانتیگراد در محلول مسدودکننده (5٪ شیر بدون چربی) انکوبه شد. سپس غشا به یک سرم رقیق شده (رقت 1:10) منتقل شد و سپس به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شد. بلات پنج بار با بافر TBST ( 0.1 M Tris، 0.1 M ) شسته شد.
(0.15 مولار NaCl، 0.05% Tween-20، pH 7.5) و سپس با آنتی‌بادی IgE بز کونژوگه شده با پراکسیداز (KPL Inc.، Gaithersburg، MD، USA) رقیق شده در TBST (1:5000) به مدت یک ساعت دیگر انکوبه شد. سپس غشاء پنج بار با TBST شسته شد و کمپلکس پروتئین-آنتی‌بادی بی‌حرکت در غشاء شناسایی شد ( BeyECL Plus، Beyotime Biotechnology Co., Ltd، پکن، چین) و با استفاده از تصویرگر ChemiDoc XRS + (Bio-Rad، Hercules، CA، USA) ثبت شد.
۲.۶.۳ سنجش جاذب ایمنی متصل به آنزیم (ELISA)
آزمایش الایزا به شرح زیر انجام شد: پلیت‌های پلی‌استایرن ۹۶ چاهکی الایزا (Costar 2592, Corning Inc., NY, USA) با نمونه‌های TM (5 میکروگرم در میلی‌لیتر ، 100 میکرولیتر در هر چاهک) در محیط بافر حاوی 0.29٪ (وزنی/وزنی) NaOH و 0.16٪ (وزنی/وزنی) Na2CO3 پوشانده شدند و به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از 5 بار شستن پلیت‌ها با TBST، محل‌های غیر اختصاصی با 5٪ شیر بدون چربی (200 میکرولیتر در هر چاهک) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت مسدود شدند . پلیت‌ها شسته شده و با 100 میکرولیتر سرم انسان (رقیق شده با TBST، حجمی/حجمی 1:10) انکوبه شدند. پس از انکوباسیون در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۱ ساعت، پلیت‌ها دوباره شسته شده و با آنتی‌بادی IgE بز کونژوگه شده با پراکسیداز (۱:۵۰۰۰، حجمی/حجمی، KPL Inc.، Gaithersburg، MD، ایالات متحده آمریکا) در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۱.۵ ساعت، ۱۰۰ میکرولیتر در هر چاهک انکوبه شدند. در نهایت، با TMB (شرکت بیوتکنولوژی Beyotime ، Ltd.، پکن، چین) رنگ ایجاد شد . پس از پایان واکنش با افزودن ۲ MH2SO4 ، جذب در طول موج ۴۵۰ نانومتر با استفاده از یک دستگاه خوانش خودکار پلیت ELISA ( SpectraMax M5، Molecular Devices، Sunnyvale، CA، ایالات متحده آمریکا) بررسی شد .
۲.۷ قابلیت هضم شبیه‌سازی‌شده دستگاه گوارش
مایع معده (SGF) از TM با استفاده از روش Astwood و همکاران (1996) با برخی اصلاحات انجام شد . بری فلای ، SGF طبق استاندارد فارماکوپه ایالات متحده ( Anonymous, 1995 ) تهیه شد. حجم کل محلول واکنش 2 میلی‌لیتر بود و نسبت پپسین به پروتئین مورد آزمایش 1:50 (وزنی/وزنی) بود. هضم در دمای 37 درجه سانتیگراد انجام شد و SGF قبل از اضافه کردن نمونه‌های TM به مدت 10 دقیقه در حمام آب با دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. در زمان‌های 0، 5، 15، 30، 40، 50 و 60 دقیقه، 100 میکرولیتر از محلول واکنش به یک لوله سانتریفیوژ 1.5 میلی‌لیتری منتقل شد و 30 میکرولیتر Na2CO3 0.2 مولار برای توقف هضم اضافه شد.
مایع روده (SIF) نیز مطابق آنچه در فارماکوپه ایالات متحده ( Anonymous, 1995 ) شرح داده شده است، تهیه شد. حجم کل محلول واکنش 2 میلی‌لیتر و نسبت تریپسین به پروتئین مورد آزمایش 1:100 (وزنی/وزنی) بود. هضم در دمای 37 درجه سانتیگراد با SIF پیش‌گرم‌شده انجام شد. در زمان‌های 0، 1، 5، 7، 15، 30، 60، 120 و 180 دقیقه، 100 میکرولیتر از محلول واکنش به یک لوله سانتریفیوژ 1.5 میلی‌لیتری منتقل شد و واکنش بلافاصله با گرم کردن در حمام آب جوش به مدت 10 دقیقه خاتمه یافت .
تیمارهای آنزیمی متوالی هضم SGF و SIF به شرح زیر انجام شد: پس از هضم SGF به مدت 1 ساعت، pH محلول SGF به 7.5 تنظیم شد و سپس SIF برای هضم SIF طبق رویه‌های شرح داده شده در بالا اضافه شد. قابلیت هضم TM و آلرژی‌زایی محصولات هضم شبیه‌سازی شده به ترتیب با استفاده از SDS-PAGE و ELISA غیرمستقیم تجزیه و تحلیل شد.
۲.۸ تحلیل آماری
داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) ارائه شدند.
از نرم‌افزار SPSS (SPSS Inc.، نسخه ۱۹، شیکاگو، ایلینوی، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. از آزمون چند دامنه‌ای دانکن ( p < 0.05) برای تعیین تفاوت‌های معنی‌دار بین میانگین‌ها استفاده شد .
۳. نتایج و بحث
۳.۱ پایداری ساختاری TM
۳.۱.۱ محتوای اسید آمینه
توالی اسید آمینه، ساختار اولیه یک پروتئین بود. تغییرات در محتوای اسید آمینه یک پروتئین می‌تواند برای انعکاس … مورد استفاده قرار گیرد .
جدول ۱ آنالیز اسید آمینه TM بدون HIU و HIU تیمار شده. اسید آمینه قدرت اولتراسونیک (وات) 0 ۱۰۰ ۲۰۰ ۳۰۰ ۴۰۰ ۵۰۰ ۶۰۰ ۷۰۰ ۸۰۰ آسپ ۵.۹۷ ± ۰.۰۳ آمپر ۶.۰۱ ± ۰.۰۵ آمپر ۵.۹۸ ± ۰.۰۲ آمپر ۵.۹۸ ± ۰.۰۳ آمپر ۵.۹۸ ± ۰.۰۴ آمپر ۵.۹۷ ± ۰.۰۳ آمپر ۵.۹۷ ± ۰.۰۲ آمپر ۶.۰۱ ± ۰.۰۳ آمپر ۵.۹۸ ± ۰.۰۴ آمپر گلو ۲۱.۷۱ ± ۰.۰۲ آمپر ۲۱.۶۸ ± ۰.۰۱ ساعت ۲۱.۶۸ ± ۰.۰۲ a ۲۱.۷۲ ± ۰.۰۴ ساعت ۲۱.۶۹ ± ۰.۰۳ ساعت ۲۱.۶۹ ± ۰.۰۲ آمپر ۲۱.۷۰ ± ۰.۰۲ آمپر ۲۱.۶۹ ± ۰.۰۳ ساعت ۲۱.۶۹ ± ۰.۰۱ آمپر سر ۴.۲۶ ± ۰.۰۵ آمپر ۴.۲۵ ± ۰.۰۲ آمپر ۴.۲۷ ± ۰.۰۳ آمپر ۴.۲۵ ± ۰.۰۴ آمپر ۴.۲۵ ± ۰.۰۲ آمپر ۴.۲۶ ± ۰.۰۵ آمپر ۴.۲۵ ± ۰.۰۳ آمپر ۴.۲۵ ± ۰.۰۴ آمپر ۴.۲۶ ± ۰.۰۳ آمپر او ۰.۴۲ ± ۰.۰۳ آمپر ۰.۴۳ ± ۰.۰۲a ۰.۴۲ ± ۰.۰۴ آمپر ۰.۴۲ ± ۰.۰۳ آمپر ۰.۴۲ ± ۰.۰۱ آمپر ۰.۴۲ ± ۰.۰۴ آمپر ۰.۴۳ ± ۰.۰۳ آمپر ۰.۴۳ ± ۰.۰۲ آمپر ۰.۴۳ ± ۰.۰۴ آمپر گلی ۰.۷۲ ± ۰.۰۴ آمپر ۰.۷۱ ± ۰.۰۳ آمپر ۰.۷۱ ± ۰.۰۲ آمپر ۰.۷۲ ± ۰.۰۱ آمپر ۰.۷۲ ± ۰.۰۴ آمپر ۰.۷۲ ± ۰.۰۳ آمپر ۰.۷۱ ± ۰.۰۱ آمپر ۰.۷۲ ± ۰.۰۲ آمپر ۰.۷۱ ± ۰.۰۳ آمپر تر ۲.۷۹ ± ۰.۰۱ آمپر ۲.۷۸ ± ۰.۰۳ آمپر ۲.۷۸ ± ۰.۰۲ آمپر ۲.۷۸ ± ۰.۰۴ آمپر ۲.۷۸ ± ۰.۰۲ آمپر ۲.۷۹ ± ۰.۰۵ آمپر ۲.۷۹ ± ۰.۰۶ آمپر ۲.۷۸ ± ۰.۰۴ آمپر ۲.۷۹ ± ۰.۰۵ آمپر ارگ ۱۰.۰۳ ± ۰.۰۶ آمپر ۱۰.۰۵ ± ۰.۰۴ آمپر ۱۰.۰۳ ± ۰.۰۲ آمپر ۱۰.۰۲ ± ۰.۰۳ آمپر ۱۰.۰۳ ± ۰.۰۵ آمپر ۱۰.۰۴ ± ۰.۰۴ آمپر ۱۰.۰۵ ± ۰.۰۲ آمپر ۱۰.۰۵ ± ۰.۰۵ آمپر ۱۰.۰۶ ± ۰.۰۳ آمپر آلا ۷.۳۹ ± ۰.۰۳ آمپر ۷.۴۰ ± ۰.۰۲ آمپر ۷.۴۰ ± ۰.۰۴ آمپر ۷.۳۹ ± ۰.۰۱ آمپر ۷.۳۹ ± ۰.۰۲ آمپر ۷.۳۹ ± ۰.۰۳ آمپر ۷.۴۱ ± ۰.۰۵ آمپر ۷.۴۰ ± ۰.۰۳ آمپر ۷.۴۰ ± ۰.۰۴ آمپر تیر ۲.۰۱ ± ۰.۰۴ آمپر ۱.۹۹ ± ۰.۰۳ آمپر ۱.۹۹ ± ۰.۰۵ آمپر ۲.۰۰ ± ۰.۰۶ آمپر ۲.۰۰ ± ۰.۰۴ آمپر ۲.۰۱ ± ۰.۰۳ آمپر ۲.۰۰ ± ۰.۰۲ آمپر ۲.۰۱ ± ۰.۰۴ آمپر ۲.۰۱ ± ۰.۰۵ آمپر سیز ۰.۳۲ ± ۰.۰۵ آمپر ۰.۳۱ ± ۰.۰۱ آمپر ۰.۳۰ ± ۰.۰۲ آمپر ۰.۳۰ ± ۰.۰۴ آمپر ۰.۲۹ ± ۰.۰۲ آمپر ۰.۲۷ ± ۰.۰۳ ab ۰.۲۱ ± ۰.۰۲ ب ۰.۱۶ ± ۰.۰۲ درجه سانتیگراد ۰.۱۱ ± ۰.۰۱ روز وال ۳.۹۵ ± ۰.۰۳ آمپر ۳.۹۴ ± ۰.۰۵ آمپر ۳.۹۴ ± ۰.۰۲ آمپر ۳.۹۵ ± ۰.۰۲ آمپر ۳.۹۳ ± ۰.۰۴ آمپر ۳.۹۳ ± ۰.۰۴ آمپر ۳.۹۵ ± ۰.۰۴ آمپر ۳.۹۴ ± ۰.۰۳ آمپر ۳.۹۵ ± ۰.۰۲ آمپر مت ۳.۲۱ ± ۰.۰۲ آمپر ۳.۲۱ ± ۰.۰۴ آمپر ۳.۲۱ ± ۰.۰۱ آمپر ۳.۲۱ ± ۰.۰۳ آمپر ۳.۲۱ ± ۰.۰۵ آمپر ۳.۲۱ ± ۰.۰۲ آمپر ۳. ۱۵ ± ۰.۰۱ ب ۳.۰۶ ± ۰.۰۲ درجه سانتیگراد ۲.۹۷ ± ۰.۰۳ روز فی ۱.۸۲ ± ۰.۰۴ آمپر ۱.۸۱ ± ۰.۰۲ آمپر ۱.۸۱ ± ۰.۰۳ آمپر ۱.۸۲ ± ۰.۰۵ آمپر ۱.۸۱ ± ۰.۰۴ آمپر ۱.۸۳ ± ۰.۰۲ آمپر ۱.۸۲ ± ۰.۰۳ آمپر ۱.۸۲ ± ۰.۰۱ آمپر ۱.۸۱ ± ۰.۰۴ آمپر ایل ۱.۷۵ ± ۰.۰۱ آمپر ۱.۷۵ ± ۰.۰۳ آمپر ۱.۷۳ ± ۰.۰۲ آمپر ۱.۷۵ ± ۰.۰۴ آمپر ۱.۷۴ ± ۰.۰۶ آمپر ۱.۷۳ ± ۰.۰۴ آمپر ۱.۷۴ ± ۰.۰۱ آمپر ۱.۷۴ ± ۰.۰۲ آمپر ۱.۴۴ ± ۰.۰۵ آمپر لئو ۱۱.۴۵ ± ۰.۰۳ ساعت ۱۱.۴۳ ± ۰.۰۶ ساعت ۱۱.۴۳ ± ۰.۰۲ آمپر ۱۱.۴۵ ± ۰.۰۱ آمپر ۱۱.۴۲ ± ۰.۰۳ ساعت ۱۱.۴۳ ± ۰.۰۵ ساعت ۱۱.۴۵ ± ۰.۰۲ آمپر ۱۱.۴۴ ± ۰.۰۳ ساعت ۱۱.۴۵ ± ۰.۰۳ ساعت لیس ۱۰.۹۷ ± ۰.۰۴ ساعت ۱۰.۹۸ ± ۰.۰۵ آمپر ۱۰. ۹۷ ± ۰.۰۴ ساعت ۱۰.۹۵ ± ۰.۰۶ آمپر ۱۰.۹۵ ± ۰.۰۵ آمپر ۱۰.۹۲ ± ۰.۰۳ آمپر ۱۰.۸۳ ± ۰.۰۲ ب ۱۰.۷۱ ± ۰.۰۳ ثانیه ۱۰.۵۲ ± ۰.۰۵ روز نکته: حروف بزرگ متفاوت در یک سطر به معنای تفاوت معنادار است ( p < 0.05).
تغییر در ترکیب آن. جدول 1 درصد وزنی (%) اسیدهای آمینه را در نمونه‌های تروپومیوزین (TM) تیمار شده با HIU و نمونه‌های غیر HIU نشان داد. در مقایسه با نمونه کنترل (0 وات)، محتوای اکثر اسیدهای آمینه TM تیمار شده با HIU هیچ تغییر معنی‌داری نداشت ( p > 0.05)، در حالی که محتوای Cys، Met و Lys در توان HIU بالاتر کاهش یافت (p < 0.05). این ممکن است به این دلیل باشد که امواج فراصوت آب منجر به تحریک الکترونیکی مولکول‌های آب می‌شوند و در نتیجه رادیکال‌های H و OH و سپس گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) مانند H2O2 به شرح زیر تشکیل می‌شوند : H2O → H % + HO % ، H % + O2 → HO2%، 2HO% → H2O2، 2HO2% → H2O2 + O2 (ماکینو، موسوبا و ریس ، 1983 ؛ ماسون و پیترز ، 2002 ؛ ریس و کوندو ، 1992 ؛ وانگ و شو ، 2012 ) . این رادیکال‌های آزاد ناشی از HIU می‌توانند به باقیمانده‌های اسید آمینه حمله کنند و منجر به از بین رفتن آنها شوند. به طور خاص ، اسیدهای آمینه گوگرد (Cys و Met) مستعد تغییرات اکسیداتیو در اکسیداسیون رادیکالی بودند. اکسیداسیون Cys منجر به تشکیل پیوندهای دی‌سولفیدی، دی‌سولفیدهای مخلوط (مثلاً با گلوتاتیون) و رادیکال‌های تییل می‌شود ( کالیانارامان ، ۱۹۹۵ ) . در مورد باقیمانده‌های متیونین ، محصول اصلی اکسیداسیون، متیونین سولفوکسید است ( ووگت، ۱۹۹۵ ). از دست دادن Lys ممکن است به این دلیل باشد که با قوی‌تر شدن HIU، محصولات تجزیه رادیکال‌های آزاد ناشی از HIU به صورت کووالانسی به Lys پیوند می‌خورند ( رکوئنا و همکاران، ۱۹۹۷ ) و در نتیجه منجر به از دست رفتن Lys می‌شوند.
۳.۱.۲ تخریب TM توسط تصفیه HIU
از آنجایی که رادیکال‌های آزاد ناشی از HIU می‌توانند اسیدهای آمینه را اکسید کنند، آیا می‌توانند به ساختار اولیه پروتئین حمله کرده و در نتیجه TM را تخریب کنند؟ همانطور که در SDS-PAGE نشان داده شده است ( شکل 1 A)، شدت باند TM با افزایش قدرت HIU به تدریج کاهش می‌یابد، که نشان‌دهنده اثرات تخریب HIU بر مولکول‌های TM است. در حالی که هیچ باند قطعه پروتئینی وجود نداشت، این ممکن است به دلیل مقدار و وزن مولکولی کم قطعات پروتئین باشد که توسط SDS-PAGE قابل تشخیص نبودند. برای مشخص کردن دقیق‌تر قطعات پروتئینی ناشی از HIU، از HPLC برای تجزیه و تحلیل نمونه‌های TM استفاده شد ( شکل 1 B – J، جدول 2 ). در گروه کنترل (0 W)، تنها یک پیک مربوط به TM وجود داشت که نشان‌دهنده خلوص بالای نمونه‌های TM بود. با قدرت توان HIU (100 تا 800 وات)، دو پیک اصلی در 100 تا 200 وات، سه پیک در 300 تا 500 وات و پنج پیک در 600 تا 800 وات وجود داشت که نشان می‌دهد HIU قوی‌تر می‌تواند مولکول‌های TM را برای تولید قطعات پروتئینی مختلف از بین ببرد. به طور خاص ، با افزایش HIU (0 تا 800 وات)، پیک TM (در حدود 5.7 دقیقه) کاهش یافت، پیک در حدود 10.25، 10.52 و 13.06 دقیقه افزایش یافت، در حالی که پیک‌ها در حدود 11.22 دقیقه در 0 تا 600 وات افزایش یافتند، سپس در 600 تا 800 وات کاهش یافتند. این نشان داد که HIU قوی‌تر باعث تخریب بیشتر مولکول‌های TM، تولید قطعات پروتئینی بیشتر و تولید قطعات پروتئینی در حدود 10.25 و 10.52 دقیقه می‌شود که ممکن است مربوط به کاهش TM یا تجزیه قطعات پروتئینی در حدود 11.22 دقیقه باشد.
منابع قبلی نشان داده‌اند که امواج فراصوت می‌توانند مولکول‌های زیستی را توسط رادیکال‌های آزاد القا شده توسط امواج فراصوت تخریب کنند ( Makino et al., 1983; Mason & Peters, 2002; Pingret , Fabiano-Tixier, & Chemat , 2013; Soria & Villamiel , 2010 ). تجزیه زیستی TM ( شکل 1 ) ممکن است به دلیل شکستن پیوندها توسط حمله رادیکال‌های آزاد القا شده توسط HIU باشد . دلایل احتمالی به شرح زیر است: گونه‌های رادیکال آزاد، اتم‌ها یا مولکول‌هایی هستند که قادر به وجود مستقل هستند و دارای یک یا چند الکترون جفت نشده می‌باشند، مانند رادیکال هیدروکسیل (HO % ) و رادیکال هیدروپروکسیل (HO2 · ) ( Tai, Gu, Zou, & Guo, 2002 ). در میان این رادیکال‌های مختلف، تصور می‌شود که رادیکال هیدروکسیل نقش اصلی را در تخریب مولکول‌های زیستی ایفا می‌کند ( Tai et al., 2002 ). رادیکال‌های هیدروکسیل به دلیل پتانسیل استاندارد بالای 2.8 ولت در مقابل الکترود هیدروژن معمولی (NHE) در محیط اسیدی و 1.55 ولت در مقابل NHE در محیط بازی، بسیار واکنش‌پذیر و غیرگزینشی هستند که با مولکول‌ها در واکنش‌های انتزاع اتم یا افزایش اتم که توسط انرژی‌های قدرت پیوند هدایت می‌شوند، واکنش می‌دهند ( García-Montaño et al., 2008; Pera-Titus, García-Molina, Baños, Giménez, & Esplugas , 2004 )، سپس ساختار اولیه مولکول‌های TM را مختل یا تجزیه می‌کنند و منجر به قطعات پروتئینی می‌شوند.
۳.۱.۳ ساختار ثانویه
ترکیبات ساختار ثانویه تروپومیوزین در شکل 2 A نشان داده شده است. تروپومیوزین ساختار یکنواختی ندارد ( Eckard & Cowgill, 1976 )، همانطور که در شکل 2 A نشان داده شده است، اجزای ساختار ثانویه در TM تیمار نشده با HIU (کنترل) شامل 78.4٪ α- مارپیچ، 5.2٪ β- ترن و 14.4٪ کویل‌های تصادفی بود که با داده‌های گزارش شده توسط Jin و همکاران (2015) مشابه بود . با افزایش توان HIU ، محتوای α- مارپیچ به طور قابل توجهی از 78.4٪ (کنترل) به 16.1٪ (800 وات) کاهش یافت ، در حالی که محتوای صفحات β ، β- ترن و کویل‌های تصادفی به طور قابل توجهی از 0 به 20.5٪، 5.2 به 22.4٪ و 14.4 به 40.6٪ افزایش یافت (p < 0.05). این نتایج نشان داد که HIU باعث تبدیل α- مارپیچ به صفحه β ، β- چرخش و کویل‌های تصادفی (عمدتاً از نوع کویل‌های تصادفی) در مولکول‌های TM می‌شود و درجه این تبدیل با قدرت HIU از 100 وات تا 800 وات همبستگی مثبت دارد. نتایج مشابهی توسط Stathopulos و همکاران (2004) گزارش شد که دریافتند پروتئین‌هایی با محتوای α- مارپیچ بالا (آلبومین سرم گاوی، میوگلوبین و لیزوزیم) دچار افزایش ساختار β می‌شوند . Hu و همکاران (2015) نیز گزارش دادند که پروتئین‌های 7S تیمار شده با HIU سطوح بالاتری از ساختار β و سطوح پایین‌تری از ساختار α- مارپیچ داشتند. Jin و همکاران. (2015) اثرات فراصوت با فرکانس جاروب‌کننده و پالسی (SFPU) و فراصوت با فرکانس دوگانه متوالی (SDFU) را بر روی گلوتلین مقایسه کردند ، هم SFUP و هم SDFU باعث افزایش صفحه بتا و کاهش مارپیچ آلفای گلوتلین شدند.
۳.۱.۴ ساختار سوم محیط آبی قطبی، بنابراین، ارتباط نزدیکی باآبگریزی سطح (S0 – ANS) شاخصی از میزان ترکیب آبگریزی پروتئین‌ها است. همانطور که در شکل 2 B نشان داده شده است، S0 – ANS گروه‌های ایندروفوبیک TM روی سطح مولکول‌های پروتئینی که با چین‌خوردگی ناشی از HIU تماس دارند، در طول 0 تا 800 وات به طور قابل توجهی افزایش یافته است (p < 0.05). نتایج فوق نشان داد که پدیده کاویتاسیون می‌تواند ترکیب TM را مختل کند و منجر به قرار گرفتن بیشتر باقیمانده‌های آبگریز و در نتیجه افزایش قدرت آبگریزی سطح شود. چندین مطالعه قبلی نیز نشان دادند که HIU می‌تواند S0 – ANS پروتئین‌های غذایی مانند پروتئین لوبیای سیاه ( Jiang و همکاران، 2014 )، آلبومین سرم گاوی ( Gülseren و همکاران، 2007 )، پروتئین زئین و گلوتلین ( Jin و همکاران، 2015 ) را افزایش دهد.
اثرات HIU بر محتوای کل و واکنش‌پذیر SH نمونه‌های TM در شکل 2C ارائه شده است. محتوای کل SH با افزایش توان HIU کاهش یافت، که ممکن است به دلیل اکسیداسیون گروه‌های SH برای تشکیل پیوندهای دی‌سولفید باشد . موج اولتراسونیک می‌تواند رادیکال‌های آزاد بسیار واکنش‌پذیر را از مولکول‌های آب تولید کند، این رادیکال‌های آزاد می‌توانند گروه‌های آزاد SH حساس را اکسید کرده و پیوندهای S e S را تشکیل دهند و در نتیجه منجر به کاهش کل گروه‌های SH شوند. محتوای سولفیدریل واکنش‌پذیر نمونه کنترل (0 وات) 12.55 ± 0.11 میکرومول بر گرم پروتئین بود ( شکل 2C ). نمونه TM تیمار شده با HIU در توان‌های 100 تا 600 وات افزایش قابل توجهی در مقایسه با نمونه کنترل نشان داد ، این ممکن است به دلیل قرار گرفتن در معرض گروه‌های SH داخلی باشد. با این حال، هنگامی که در طول 700 تا 800 وات تحت درمان قرار گرفت، محتوای سولفیدریل واکنش‌پذیر به طور قابل توجهی کاهش یافت (p < 0.05، در مقایسه با 600 وات)، که ممکن است به دلیل اکسیداسیون رادیکال‌های آزاد بیشتر تولید شده در طول کاویتاسیون اولتراسونیک قوی‌تر باشد. در 800 وات، محتوای SH کل و واکنش‌پذیر تقریباً به یک مقدار بود ، که نشان می‌دهد تقریباً همه گروه‌های سولفیدریل در معرض محیط خارجی قرار گرفته‌اند.
۳.۱.۵ اندازه ذرات و پتانسیل زتا
همانطور که در شکل 2 D نشان داده شده است، میانگین اندازه ذرات TM به طور واضح از 322 نانومتر (0 وات) به 197 نانومتر (800 وات) با قدرت توان HIU کاهش یافت (p < 0.05)، در حالی که تروپومیوزین یک پروتئین با طول 400 آنگستروم (40 نانومتر) بود ( Frank & George, 2000 )، بنابراین مولکول‌های TM به صورت تجمعی بودند. با افزایش قدرت HIU، کاهش اندازه احتمالاً به دلیل تفکیک پروتئین در طول کاویتاسیون بود که شامل تخریب آگلومره‌ها و تجمعات بود. مطالعات متعددی تأثیر سونیکاسیون بر اندازه ذرات پروتئین‌های مختلف را بررسی کرده و یافته‌های مشابهی گزارش شده است. Jambrak ، Lelas، Mason، Kre š i ć و Badanjak (2009) دریافتند که سونیکاسیون با استفاده از یک پروب 20 کیلوهرتز به مدت 15 و 30 دقیقه، اندازه ذرات را در محلول‌های پروتئین سویا کاهش می‌دهد. Hu و همکاران. (۲۰۱۳) دریافتند که اندازه ذرات پراکندگی‌های SPI عمل‌آوری‌شده با HIU پس از عمل‌آوری در توان ۴۰۰ وات کاهش یافت، و ژائو و همکاران (۲۰۱۴) دریافتند که نمونه‌های شیر پیش عمل‌آوری‌شده با HIU کوچکتر و از نظر اندازه یکنواخت‌تر بودند.
پتانسیل زتای تمام نمونه‌های TM منفی بود ( شکل 2 E)، که نشان می‌دهد اسیدهای آمینه منفی بیشتری نسبت به اسیدهای آمینه مثبت روی سطح پروتئین وجود دارد. نتایج فعلی نشان داد که مقدار مطلق پتانسیل زتای نمونه‌های TM تیمار شده با HIU با قدرت اولتراسونیک بالاتر افزایش می‌یابد ( شکل 2 E). اولتراسونیک قوی‌تر، پتانسیل زتای پروتئین را با جدا کردن تجمعات پروتئین، تغییر ترکیب و ساختار پروتئین به روشی که اسیدهای آمینه یا گروه‌های باردار (COO-) از داخل به سمت آب باز می‌شوند، افزایش داد ( Morel , Dehlon , Autran, Leygue , & Bar- L ‘ Helgouac’h , 2000 ) . 3.2. قابلیت هضم آزمایشگاهی شبیه‌سازی شده TM
قابلیت هضم TM تیمار شده با HIU با SDS-PAGE تعیین شد. همانطور که در شکل 3 A1 نشان داده شده است، باند مربوط به جرم مولکولی حدود 38 کیلو دالتون به TM اشاره دارد.
پنج دقیقه اول شروع به هضم کرد ، قطعاتی حدود 34، 28 و 17 کیلو دالتون شناسایی شدند ( شکل 3 A2). باند پروتئینی حدود 34 کیلو دالتون در هضم 30 دقیقه‌ای ناپدید شد ( شکل 3 A3-4 ). باند جدید حدود پروتئین‌های 19 و 14 کیلو دالتون در هضم 40 دقیقه‌ای شناسایی شدند ( شکل 3 A5 ). با پیشرفت SGF ( شکل 3 A6-7 )، باند TM و 28 کیلو دالتون ضعیف‌تر شد، در حالی که باند 17 کیلو دالتون متراکم‌تر شد. در SGF در مدت زمان 50 تا 60 دقیقه ( شکل 3 A6-7 ) ، در مقایسه با گروه کنترل (خط 1، شکل 3 A6-7 )، باند 28 کیلو دالتونی با هضم 50 تا 60 دقیقه ضعیف‌تر شد، که ممکن است به این دلیل باشد که تیمار اولتراسونیک ساختار آن را شل می‌کند و باعث می‌شود آنزیم به راحتی بتواند به قطعاتی که باید شکسته شوند، نفوذ کند و با آنها تماس پیدا کند ( یو و همکاران، 2012 ). در هضم SGF در مدت زمان 60 دقیقه ( شکل 3 A7)، هنوز TM در محصولات هضم SGF وجود داشت که نشان دهنده هضم بالای SGF است.
مقاومت TM در برابر هضم معده‌ای. در مقایسه با قابلیت هضم SGF گزارش‌شده قبلی از سایر آلرژن‌های تروپومیوزین سخت‌پوستان با هضم SGF 60 دقیقه‌ای، TM از Exopalaemon modestus مقاومت هضم SGF بالاتری نسبت به سایر آلرژن‌های TM از میگو ( Solenocera) داشت. ملانتو ، گامز و همکاران. (2015) )، از ماهی مرکب ( Todarodes paci fi cus، Jin et al. (2015) ) و از خرچنگ (Scylla serrata، Huang et al. (2010) ).
در هضم SIF، پس از هضم به مدت 1 دقیقه، باند TM ناپدید شد و یک قطعه با وزن حدود 24 کیلو دالتون مشاهده شد ( شکل 3 B2). در عرض 1 تا 7 دقیقه هضم ( شکل 3 B2-4 ) ، 24 کیلو دالتون ضعیف‌تر شد و پس از هضم SIF به مدت 15 دقیقه ناپدید شد ( شکل 3 B5). با طولانی شدن هضم SIF تا 30 تا 180 دقیقه ( شکل 3 B6-7 )، هیچ باند پروتئینی قابل مشاهده‌ای در SDS-PAGE وجود نداشت. الگوهای هضم متفاوت مشاهده شده بین پپسین (SGF) و تریپسین (SIF) به دلیل ویژگی‌های برش متفاوت برای پیوندهای پپتیدی بود ( Huang و همکاران ، 2010 ). پپسین تمایل به شکستن پیوند پپتیدی در مجاورت باقیمانده‌های فنیل‌آلانین یا تیروزین داشت، در حالی که تریپسین بیشتر در مجاورت لیزین و آرژنین تمایل به شکستن داشت ( Mikita & Padlan, 2007 ). ثابت شد که TM به دلیل محتوای کم فنیل‌آلانین و تیروزین (1.82٪ و 2.01٪ در جدول 1 ) و محتوای بالای لیزین و آرژنین (10.97٪ و 10.03٪ در جدول 1 ) در TM، در برابر پپسین مقاوم است، در حالی که به هضم تریپسین نسبتاً حساس است ( Huang et al., 2010 ).
شکل 3. قابلیت هضم معده‌ای (A)، روده‌ای (B) و هضم‌پذیری متوالی معده‌ای و روده‌ای (C) تروپومیوزین بدون HIU و تیمار شده با HIU با SDS-PAGE (توجه: M، نشانگر؛ لاین 1، کنترل؛ لاین 2، 100 وات؛ لاین 3، 200 وات؛ لاین 4، 300 وات؛ لاین 5، 400 وات؛ لاین 6، 500 وات؛ لاین 7، 600 وات؛ لاین 8، 700 وات؛ لاین 9، 800 وات).
ابتدا با استفاده از هضم معده‌ای انجام شد ، سپس pH به 7.5 تنظیم شد و به طور مداوم توسط هضم روده‌ای هیدرولیز شد. نتایج نشان داد که در عرض 1 دقیقه هضم SIG ( شکل 3 C2)، باندهای حدود 38 کیلو دالتون (TM)، 28 کیلو دالتون ، 19 و 17 کیلو دالتون از پیش هیدرولیز هضم پپسین ( شکل 3 C1) ناپدید شدند، باند حدود 14 کیلو دالتون ضعیف‌تر شد و باندهای ضعیف جدیدی در حدود 24 و 12 کیلو دالتون ایجاد شد ( شکل 3 C2). باند حدود 14 کیلو دالتون با هضم 7 دقیقه‌ای ناپدید شد ( شکل 3 C4)، باندهای ضعیف متوسط جدیدی در حدود 10 کیلو دالتون ایجاد کرد ( شکل 3 C4) و سپس با هضم 30 دقیقه‌ای ناپدید شد ( شکل 3 C6). باندهای حدود 24 و 12 کیلو دالتون با هضم روده‌ای بیشتر از 60 دقیقه ناپدید شدند ( شکل 3 C7). وقتی هضم SIF به 60 تا 180 دقیقه طول کشید ( شکل 3 C7-9 )، هیچ باند پروتئینی قابل مشاهده‌ای وجود نداشت. در مقایسه با SIF تکی، هضم متوالی SGF و SIF زمان بسیار بیشتری (15 دقیقه برای هضم SIF، 60 دقیقه برای هضم متوالی SGF و SIF) طول کشید تا هیچ باند قابل مشاهده‌ای از TM و قطعات پروتئینی در SDS-PAGE مشاهده نشود، که نشان می‌دهد هضم پپسین ممکن است برخی از مکان‌های هیدرولیز فضایی را روی TM برای هضم تریپسین از قبل مختل کند، که هضم تریپسین بعدی را به تأخیر می‌اندازد.
۳.۳ آلرژی‌زایی
۳.۳.۱ حساسیت‌زایی TM تحت درمان با HIU
تغییرات در آلرژی‌زایی TM تحت درمان با HIU با آنالیز ایمونوبلاتینگ با استفاده از سرم‌های انسانی بیماران مبتلا به آلرژی به میگو تأیید شد. همانطور که در شکل 4 A نشان داده شده است ، TM تحت درمان با HIU به تدریج با افزایش توان، پاسخ ایمنی ضعیف‌تری نشان داد و پاسخ ایمنی پس از درمان HIU در 800 وات ناپدید شد، که ممکن است به دلیل تخریب اپی‌توپ‌های ساختاری یا خطی TM توسط امواج فراصوت باشد.
شکل ۳. (ادامه)
همانطور که در شکل 4 A و B نشان داده شده است، ایمونوبلاتینگ و ELISA تغییرات مشابهی داشتند. در حالی که تغییرات در آلرژی‌زایی آزمایش شده توسط وسترن بلات بیشتر از کاهش به‌دست‌آمده توسط ELISA بود، به‌ویژه در 800 وات، جایی که ایمونوبلاتینگ هیچ پاسخ ایمنی نداشت، در حالی که OD 450 هنوز مقدار 0.95 داشت. این نشان می‌دهد که برخی از قطعات پروتئینی القا شده توسط HIU با آلرژی‌زایی را نمی‌توان با وسترن بلات تشخیص داد، اما می‌توان آنها را با ELISA آزمایش کرد. تفاوت بین نتایج وسترن بلات و ELISA ممکن است به این دلیل باشد که در ایمونوبلاتینگ، برخی از قطعات پروتئینی کوچکتر با اپی‌توپ‌ها به غشای PVDF منتقل نشده‌اند و باعث از بین رفتن اجزای آلرژیک می‌شوند، بنابراین هیچ پاسخ ایمنی مربوطه را ندارند. دلیل دیگر این بود که برخی از اپی‌توپ‌های خطی که هنگام تیمار با HIU از آلرژن جدا می‌شوند، این اپی‌توپ‌ها را نمی‌توان با ایمونوبلاتینگ تشخیص داد، اما می‌توان آنها را با ELISA اندازه‌گیری کرد ( لی و همکاران، 2001 ). بنابراین، در مقایسه با دو روش، ELISA بهتر از وسترن بلات می‌توانست آلرژی‌زایی واقعی را منعکس کند. در نتیجه، ELISA برای آزمایش بیشتر آلرژی‌زایی محصولات هضم به کار گرفته شد.
۳.۳.۲ آلرژی‌زایی SGF، SIF و محصولات هضم متوالی SGF و SIF
شکل ۳. (ادامه)در هضم SGF ( شکل 4 C)، با افزایش زمان هضم، OD 450 محصولات هضم به تدریج کاهش یافت، که نشان می‌دهد بخشی از اپی‌توپ‌های ساختاری یا خطی TM توسط پپسین هیدرولیز شده‌اند . در حالی که پس از هضم SGF به مدت 60 دقیقه، هنوز مقدار نسبتاً بالایی از OD 450 وجود داشت ، که نشان می‌داد پپسین به دلیل محتوای کم جایگاه‌های هیدرولیز خود نمی‌تواند TM را به طور کامل هیدرولیز کند (پپسین تمایل دارد پیوند پپتیدی را در کنار باقیمانده‌های فنیل‌آلانین یا تیروزین بشکند ( Mikita & Padlan, 2007 )، در حالی که محتوای TM در جدول 1، 1.82٪ فنیل‌آلانین و 2.01٪ تیروزین است ). در مورد قدرت HIU، وقتی HIU قوی‌تر شد، OD 450 محصولات هضم نیز کاهش یافت و در طول 600 تا 800 وات، OD 450 سرعت کاهش نسبتاً بالاتری در طول هضم 0 تا 15 دقیقه داشت، که ممکن است به این دلیل باشد که HIU OD را شل کرده است.
شکل ۴. ایمونوبلاتینگ (A) و آلرژی‌زایی (B) TM، آلرژی‌زایی محصول شبیه‌سازی شده هضم معده (C)، محصول شبیه‌سازی شده هضم روده (D) و محصول شبیه‌سازی شده متوالی هضم معده و روده (E) تروپومیوزین بدون HIU و تیمار شده با HIU (میانگین ± انحراف معیار، n = ۳). حروف بالانویس متفاوت به معنای تفاوت‌های معنی‌دار بین مقادیر با قدرت اولتراسونیک متفاوت است (p < ۰.۰۵) (توجه: A: خط ۱، کنترل؛ خط ۲، ۱۰۰ وات؛ خط ۳، ۲۰۰ وات؛ خط ۴، ۳۰۰ وات؛ خط ۵، ۴۰۰ وات؛ خط ۶، ۵۰۰ وات؛ خط ۷، ۶۰۰ وات؛ خط ۸، ۷۰۰ وات؛ خط ۹، ۸۰۰ وات).
ساختار TM برای اینکه پپسین به راحتی بتواند استفاده /نفوذ کند و با TM تماس پیدا کند تا شکافته شود ( یو و همکاران، ۲۰۱۲ ).
در هضم SIF ( شکل 4 D)، با پیشرفت هضم SIF، OD 450 محصولات هضم به سرعت به سطح پایینی کاهش یافت، که نشان می‌دهد اکثر اپی‌توپ‌های ساختاری و خطی TM می‌توانند توسط تریپسین هیدرولیز شوند، به دلیل مکان‌های متعدد قابل دسترس TM برای تریپسین (محتوای بالای آرژنین و لیزین در TM، جدول 1 ). همچنین، با تقویت HIU، OD 450 محصولات هضم نیز کاهش یافت، که ممکن است به این دلیل باشد که HIU با قرار گرفتن در معرض مکان‌های برش، تغییرات ساختاری را القا کرده تا حساسیت پروتئین به تریپسین را افزایش دهد. در حالی که قطعات هضم تریپسین TM حتی با طولانی شدن هضم SIF تا 180 دقیقه، هنوز توانایی اتصال به IgE را داشتند.
در مقایسه با OD 450 هضم SGF ( شکل 4 C) یا هضم SIF ( شکل 4 D)، شکل 4 E نشان داد که آلرژی‌زایی نمونه‌های هضم TM تولید شده توسط هضم متوالی معده و هضم روده، کمترین OD 450 را داشت ، این ممکن است به این دلیل باشد که هیدرولیز متوالی TM با دو آنزیم می‌تواند پیوندهای پپتیدی بیشتری را نسبت به آنزیم واحد بشکند و پپتیدهایی با اپی‌توپ‌های کمتر تولید کند و بنابراین آلرژی‌زایی را به طور مؤثرتری کاهش دهد. علاوه بر این، اگرچه پپسین زمان هضم تریپسین بعدی را طولانی‌تر کرد ( شکل 3 B و C)، اما در مورد هضم SIF و هضم متوالی SGF و SIF، نتایج آلرژی‌زایی در شکل 4 E کمتر از نتایج شکل 4 D بود و تمایل کاهشی یکسانی داشتند. این نشان می‌دهد که تریپسین نقش مهم‌تری در هضم دستگاه گوارش نسبت به پپسین ایفا می‌کند و هضم متوالی SGF و SIF در کاهش آلرژی‌زایی TM مؤثرتر از هضم تکی SGF یا SIF بود .
قابلیت هضم پایین SGF و در نتیجه ماندگاری TM دست نخورده در شکل 3 A با اپی‌توپ‌های ساختاری و متوالی کافی ، منجر به آلرژی‌زایی بالاتر در محصولات هضم SGF شد. هیدرولیز بعدی نمونه‌ها با تریپسین (هضم SIF) مولکول‌های دست نخورده باقی مانده TM را به طور قابل توجهی هیدرولیز کرد، همانطور که توسط داده‌های الکتروفورز و ELISA مشاهده شد، که منجر به کاهش آلرژی‌زایی شد (p < 0.05). بنابراین، اگرچه TM به سختی توسط پپسین هضم شد ، اما اقدامات پروتئولیتیک متعدد تریپسین در هیدرولیز آن تا حدی مؤثر بود که آلرژی‌زایی آن را به طور قابل توجهی کاهش داد ( Chicón , Belloque , Alonso, & López-Fandiño, 2008 ). علاوه بر این، تیمار HIU به طور قابل توجهی بر هضم پپسین و تریپسین و در نتیجه آلرژی‌زایی آنها تأثیر گذاشت، زیرا HIU تغییرات ساختاری TM و تجمعات TM را القا کرد که منجر به قرار گرفتن در معرض محل‌های برش پپسین و تریپسین شد که منجر به افزایش هضم‌پذیری و در نتیجه کاهش آلرژی‌زایی شد.
